Selection of human Embryonic stem cell lines for future Megakaryocytic or Erythrocytic differentiation from the hESC bank

摘要

目的：为了评估中南大学生殖与干细胞研究所自主建立的人胚胎干细胞系的质量，如多能性、自我更新的能力及多向分化潜能，并分析与巨核细胞-红细胞分化相关的关键转录因子RUNX-1、GATA-1、FOG-1和KLF-1的表达模式。
　　 方法：chHES-8,chHES-22,chHES-26,chHES-51,chHES-55,chHES-60,chHES-137,chHES-254,chHES-268,chHES-281,chHES-282,chHES-283，chHES-284均在鼠饲养层细胞上培养，对所有细胞系进行胚胎干细胞特异性标记的免疫荧光染色、端粒酶活性检测和核型分析。
　　 为了检测hESCs的分化能力，体外分化采用悬浮不添加bFGF的体系进行hESCs自发分化，三周后进行三胚层标记的免疫荧光染色。体内分化采用将hESCs注射至8周龄重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)大腿肌肉，8周后取出畸胎瘤进行H&E染色，染色结果可见来自三胚层的组织结构。
　　 为了排除MEFs对转录因子和基因表达检测结果的干扰，hESCs在无饲养层条件下mTeSR培养3-4天，收集细胞抽提RNA，RT-PCR检测多能性相关基因的表达。
　　 结果：hESC表达胚胎干细胞标记AKP,SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81和OCT-4。所有细胞系均高表达多能性相关基因OCT3/4、NANOG、SOX2、TERF1、THY-1、REX-1和LEFTA。G显带分析均显示正常核型，46，XY或46，XX。hESC体外自发分化3周后进行免疫荧光染色，表达三胚层标记β-tubulin-Ⅲ，SMA和AFP。hESC在体内形成的畸胎瘤H&E染色，染色结果可见来自三胚层的组织结构，神经管、软骨和腺上皮。巨核细胞-红细胞发育相关的关键转录因子FOG-1，GATA-1，KLF-1，FLI-1，Runx-1在不同细胞系的表达有差异。
　　 chHES-281和chHES-284高表达KLF-1和FOG-1。chHES-137高表达FLI-1和FOG-1。chHES-8只表达FLI-1。所有细胞系均低表达或不表达RUNX-1和GATA-1。除了chHES-281和chHES-284，其它细胞系均低表达或不表达KLF-1。
　　 结论：
　　 1.所有hESC细胞系均表达干细胞相关标记，具有自我更新和多向分化潜能。
　　 2.巨核细胞-红细胞发育特异性转录因子在不同hESC细胞系表达有差异。
　　 3.部分hESC细胞系高表达巨核细胞或红细胞特异性转录因子，理论上，这些hESC细胞系可进一步向巨核细胞或红细胞分化。
　　 4.RUNX-1，GATA-1，KLF-1在大多数hESC细胞系表达较低，这也是有些hESC细胞系不具有巨核细胞或红细胞分化能力的原因之一。
　　 5.我们的实验结果有助于进一步研究调控hESC定向向巨核细胞或红细胞分化的信号通路，最终获得hESC来源的临床应用型血小板和红细胞。