味噌抗HBV活性成分研究

摘要

乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，给人类的健康造成巨大威胁。目前临床抗HBV药物主要为核苷类药物，此类药物能有效地抑制病毒复制，但不能彻底清除病毒，而且停药后易复发，容易导致耐药性等问题。从天然产物中寻找具有抗HBV活性的先导化合物，对开发新型抗HBV药物具有重要意义。
　　前期研究发现味噌具有较好的抗HBV活性，进一步研究发现其活性部位为正丁醇萃取部位。在HepG2.2.15细胞模型体外抗HBV活性筛选的指导下，对味噌抗HBV活性部位开展系统的化学成分研究，评价了分离得到的单体化合物的体外抗HBV活性，初步分析了异黄酮类活性化合物的构效关系。
　　味噌（みそ，miso）是日本的一种传统大豆发酵产品，与中国的豆瓣酱、豆豉，日本的纳豆，韩国的chungkookjang、doenjang等相似，在亚洲国家作为调味品食用具有悠久的历史。
　　本课题通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、C18反相柱色谱和PHPLC等手段对味噌抗HBV活性部位进行分离纯化，从中分离得到33个化合物，通过ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HMBC等波谱分析，鉴定了其中27个化合物，分别为:环-（脯氨酸-甘氨酸）(FSE-1)、环-（苯丙氨酸-酪氨酸）(FSE-2)、环-（亮氨酸-酪氨酸）（FSE-3）、4'，7，8-三羟基-6-甲氧基异黄酮(FSE-4)、4'，5，7，8-四羟基异黄酮（FSE-5）、4'，7，8-三羟基异黄酮(FSE-6)、黄豆黄素（FSE-7）、染料木素(FSE-8)、大豆素(FSE-9)、异亮氨酸(FSE-10)、缬氨酸(FSE-11)、亮氨酸(FSE-12)、焦谷氨酸甲酯(FSE-13)、酪氨酸(FSE-14)、N-甲基亮氨酸(FSE-15)、苯丙氨酸(FSE-16)、苯丙氨酸甲酯（FSE-17）、N-乙酰苯丙氨酸（FSE-18）、谷氨酸(FSE-19)、甘氨酸(FSE-20)、天冬氨酸(FSE-21)、尿嘧啶（FSE-22）、胸腺嘧啶(FSE-23)、山嵛酸(FSE-24)、棕榈酸（FSE-25）、邻苯二酚(FSE-26)和胡萝卜苷(FSE-27)。单体化合物涉及3个环肽类、6个异黄酮类、12个氨基酸类、以及6个其他类化合物，其中24个化合物为首次从味噌中分离得到，18个化合物为发酵作用下新生成的二次成分。
　　采用HepG2.2.15细胞模型对分离得到的27个单体化合物进行体外抗HBV活性评价，首次发现了5个具有一定抗HBV活性的化合物（FSE-5、FSE-6、FSE-13、FSE-19和FSE-23）。化合物FSE-13对HepG2.2.15细胞表面抗原和e抗原分泌均具有抑制作用，最大抑制率为22.9％和42.7％（500.0μg/mL，3.50μM）;化合物FSE-19特异性地抑制e抗原的分泌，最大抑制率为37.6％(500μg/mL，3.40μM);化合物FSE-23对表面抗原和e抗原分泌均具有抑制作用，最大抑制率为50.2％和41.3％（250μg/mL，1.98μM）;化合物FSE-5和FSE-6对表面抗原和e抗原分泌具有抑制作用，最大抑制率分别为19.9％和17.1％(100μg/mL,0.35μM),15.4％和24.6％(5μg/mL,18.5nM)。
　　初步分析了活性异黄酮类化合物的构效关系:异黄酮母核无6位甲氧基取代对化合物的抗HBV活性具有一定作用，表现为FSE-6＞ FSE-4;8位羟基取代可能有助于提高异黄酮化合物的抗HBV活性，表现为FSE-5＞FSE-8，FSE-6＞FSE-9。
　　本课题的研究将有助于发现大豆发酵过程中新生成的二次成分，阐明味噌抗HBV活性物质基础，初步揭示活性化合物的构效关系，为抗HBV药物的研发提供候选，为发酵大豆产品的进一步开发利用提供依据。图32副，表4个，参考文献45篇。