RSK2通过调节STAT2活性介导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞

摘要

STAT2是核转录因子STAT家族成员，JAK/STAT途径是其活化的经典途径，STAT2通过酪氨酸磷酸化而具有转录活性。RSK2是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，可磷酸化多种底物，从而在不同刺激下在特定微环境中调节细胞增殖、分化、凋亡、存活等生物学效应。
　　目的:探讨RSK2活化STAT2促进单核细胞分化的机制。
　　方法:用CheckMateTM Mammalian Two-Hybrid system结合报道基因技术研究RSK2与STAT2的相互作用，根据RSK2功能域，构建RSK2不同缺失片段的真核表达质粒，分别与pCMV-Myc-STAT2质粒共转染HEK293细胞，免疫共沉淀技术探讨RSK2与STAT2结合及结合的具体功能域;构建Cy1(VH3)-luc报告质粒，与pcDNA4-RSK2和pCMV-Myc-STAT2共转染HEK293，检测荧光素酶活性;荧光显微镜术和胞浆胞核分离结合免疫印迹技术检测PMA刺激下STAT2的核移位;PMA刺激HEK293细胞，不同时间点收集细胞裂解液，免疫沉淀技术结合免疫印迹技术检测STAT2的丝氨酸-苏氨酸磷酸化;纯化获得GST-STAT2融合蛋白作为底物，免疫共沉淀获得活化RSK2作为激酶，进行体外激酶实验，检测STAT2的磷酸化;转染RSK2和STAT2质粒于单核细胞THP-1，PMA刺激后，直接光学显微镜观察和流式细胞术观察细胞形态变化、采用XTT实验间接检测细胞贴壁率。
　　结果:RSK2通过N-端与STAT2结合，PMA刺激下RSK2磷酸化STAT2，促进STAT2的反式转录活性和核移位。体外实验证明STAT2的C-端和N-端存在被RSK2磷酸化的丝氨酸残基。初步实验表明活化的RSK2激活STAT2促进THP-1分化。
　　结论:PMA刺激活化MAPK/ERK1/2/RSK2途径，活化的RSK2使STAT2发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化并移位入核，发挥反式转录活性，进而促进THP-1单核细胞分化为巨噬细胞。我们的研究为通过对信号转导途径的研究阐明细胞生物学行为分子机理提供了一个重要实验依据。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 主要抗体

2．1．3 主要试剂和试剂盒

2．1．4 引物和shRNA寡核苷酸序列

2．1．5 质粒

2．1．6 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞转染

2．2．3 CheckMateTM Mammalian Two-Hybrid系统分析蛋白与蛋白的结合

2．2．4 荧光素酶报告基因活性分析

2．2．5 免疫沉淀和免疫印迹技术

2．2．6 荧光显微镜技术

2．2．7 生物信息学方法预测STAT2潜在的磷酸化位点

2．2．8 体外激酶试验

2．2．9 XTT法检测THP-1细胞贴壁率

2．2．10 流式细胞仪术检测THP-1分化的细胞形态学改变

2．2．11 构建pGEX-NFAT3 Del原核表达质粒

2．2．12 构建沉默内源性SRK2和STAT2基因表达的小分子干扰RNA真核表达质粒

2．2．13 胞浆胞核蛋白分离

2．2．14 统计学处理

3 结果

3．1 RSK2结合STAT2

3．1．1 CheckMateTM Mammalian Two-Hybrid系统结合报道基因分析证实RSK2与STAT2结合

3．1．2 免疫共沉淀和免疫印迹技术分析进一步证明RSK2与STAT2结合

3．1．3 RSKA通过N端结合STAT2

3．2 RSK2促进STAT2反式转录活性

3．3 RSK2促进STAT2核移位

3．3．1 荧光显微镜技术证实RSK2促进STAT2核移位

3．3．2 分离胞浆胞核蛋白结合免疫印迹技术分析证实RSK2促进STAT2核移位

3．4 活化的RSK2使STAT2发生丝氨酸／苏氨酸磷酸化

3．4．1 生物信息学方法预测STAT2潜在的丝氨酸／苏氨酸磷酸化位点

3．4．2 体外激酶实验证明活化的RSK2使STAT2发生丝氨酸／苏氨酸磷酸化

3．4．3 细胞内实验证明活化的RSK2使STAT2发生丝氨酸／苏氨酸磷酸化

3．5 RSK2通过活化STAT2促进单核细胞THP-1的分化

3．5．1 活化的RSK2通过STAT2促进THP-1细胞分化的形态学改变

3．5．2 活化的RSK2促进STAT2介导的THP-1细胞贴壁

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 MAPK信号转导途径参与单核细胞分化研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢