白芍有效成分芍药苷的UPLC法测定及其对胶原诱导性关节炎大鼠的影响

摘要

目的:
　　采用超高效液相色谱法对白芍有效成分芍药苷的定量测定及白芍煎剂灌胃SD大鼠后吸收入血成分的定性测定，探讨吸收入血成分对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的治疗作用，寻找痹肿消汤治疗RA的有效单体。
　　方法:
　　1.采用超高效液相色谱法测定白芍有效成分芍药苷含量，色谱柱:(ACQUITY UPLC BEH C182.1×50mm Column,1.7μm)，流动相:乙腈(A)和1％醋酸水(B)，梯度洗脱，流速:0.25mL/min，柱温:40℃，检测波长:190-480nm。绘制标准曲线，并对其精密度、回收率、样本稳定性和重复性进行验证。
　　2.运用上述超高效液相色谱法对SD大鼠灌胃白芍煎剂后血浆中有效成分进行定性检测。
　　3.采用牛Ⅱ型胶原混合弗氏佐剂诱导SD大鼠复制CIA动物模型，以芍药苷标准品灌胃给药干预，通过其对与RA发生发展密切相关的血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α含量的影响，从低、中、高剂量中筛选出芍药苷治疗胶原诱导性关节炎大鼠的最佳剂量，并对大鼠一般情况、体重增长变化、关节炎指数积分、足爪肿胀度、足爪影像学、关节滑膜病理学及血清IL-1β、TNF-α含量变化进行评估，探讨芍药苷对类风湿性关节炎模型的治疗作用。
　　结果:
　　1.在5min内，白芍有效成分芍药苷获得良好分离，测得白芍生药中芍药苷含量为0.73mg/g。芍药苷在其检测范围内线性关系良好，R2＞0.9993;日内、日间精密度良好，其相对标准差(RSD)波动在0.98％-3.65％之间;白芍煎剂在24小时内稳定性良好，RSD＜2.64％;白芍煎剂重复性良好，RSD＜2.68％;芍药苷的加样回收率良好，加样回收率在98.5％-103.5％之间，RSD＜2.7％。
　　2.灌胃白芍煎剂30min后，在SD大鼠血浆中成功检测出活性物质芍药苷。
　　3.低、中、高不同剂量的芍药苷能不同程度地下调CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，中剂量效果更明显。
　　4.以中剂量芍药苷干预CIA大鼠:①一般情况观察:模型组大鼠精神委靡，饮食、活动减少，后期可见毛发枯燥等症状;治疗组、正常组大鼠未见以上表现。②体重增长变化情况:模型组、治疗组大鼠较正常组大鼠体重增长缓慢;治疗3周后，治疗组大鼠与模型组大鼠比较体重增长明显(P＜0.01)。③关节炎指数评分:随着病程延长，模型组、治疗组大鼠关节炎指数积分逐渐增加，在第21天左右达到高峰;在第35天、42天时，治疗组大鼠关节炎指数明显低于模型组(P＜0.05)。④足爪肿胀度测量:模型组大鼠足爪肿胀较正常组肿胀明显(P＜0.05)，随着病程延长，足爪肿胀度逐渐升高;治疗2周后，治疗组大鼠足爪肿胀度与模型组比较明显减轻(P＜0.05)。⑤关节X线摄片观察:免疫后14天左右，模型组大鼠踝关节软组织肿胀明显，随着病程延长，出现足趾关节骨密度降低、明显骨侵蚀病灶、关节间隙狭窄甚至消失等表现。治疗4周后，治疗组大鼠关节周围组织肿胀程度明显减轻，骨质破坏程度不明显。⑥滑膜病理学观察:免疫后42天，模型组大鼠滑膜可见大量血管翳形成、炎性细胞浸润、滑膜增厚等病理特征;治疗4周后，治疗组可见少量新生血管及炎性细胞浸润，滑膜轻度增厚。⑦血清IL-1β、TNF-α水平检测:在第28天、42天时，模型组、治疗组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平较正常组明显升高(P＜0.01)，但治疗组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显低于模型组(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.建立了白芍有效成分芍药苷经胃吸收入血的UPLC检测法。
　　2.低、中、高不同剂量的芍药苷能不同程度地下调CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，中剂量效果更明显。
　　3.芍药苷可明显降低CIA大鼠血清炎性细胞因子水平，减轻炎症反应，抑制骨质破坏，延缓病程的进展，提示芍药苷是治疗RA的有效单体，白芍是痹肿消汤治疗RA的有效组方之一。