NO/NOS在侧支血管生长中对血管VE-cadherin表达及通透性的影响

摘要

第一部分股动脉结扎诱导的侧支血管生长及血管VE-cadherin表达和通透性变化
　　目的:研究细胞粘附连接中的重要分子—血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin)表达和血管通透性在大鼠股动脉结扎诱导的侧支血管生长过程中的改变情况，探讨VE-cadherin表达、通透性变化对侧支血管生长的影响，丰富侧支血管生长机制中的炎症形成理论。
　　方法:成年Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，分为正常对照组、假手术组和股动脉结扎组。股动脉结扎组大鼠行股动脉结扎以诱导侧支血管生长。存活1周和4周，采用明胶-四氧化三铅血管造影、苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining，H.E.)染色和共聚焦免疫荧光组织化学等方法，观察大鼠股动脉结扎后的侧支血管生长的情况和VE-cadherin表达变化，并用伊文思蓝(Evance blue，EB)通透性实验检测血管通透性变化。
　　结果:股动脉结扎组动物存活1周后，可见侧支血管呈网状分布，与假手术组比较，侧支血管数目和管腔面积均增加;Ki67（细胞增殖标志物）表达增加，血管处于增殖生长状态，VE-cadherin表达下降，并且阳性染色分布不均匀，EB渗出量增加。股动脉结扎组存活4周后，与存活1周比较，侧支血管管腔面积、血管数目进一步增加，VE-cadherin表达上调并恢复至正常水平，EB渗出量和Ki67表达减少。假手术组的VE-cadherin表达、EB渗出量和血管增殖与正常对照组无明显差异。
　　结论:①大鼠股动脉结扎后侧支血管数量增加、管腔面积增加;②VE-cadherin的表达和血管通透性在侧支血管生长过程中发生变化，在生长活跃的侧支血管（股动脉结扎后1周），VE-cadherin表达下调，粘附连接结构破坏，通透性增加;在发育成熟的侧支血管(4周)，VE-cadherin表达增加至正常水平，通透性降低。
　　第二部分 NO/NOS对侧支血管生长过程中VE-cadherin表达和通透性的影响
　　目的:使用药物改变体内一氧化氮(nitric oxide，NO)水平，观察其对侧支血管生长及血管VE-cadherin、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)的表达变化，以及对侧支血管通透性和炎症细胞浸润的影响，探讨外源性药物对侧支血管内皮通透性、侧支血管炎症形成和生长的影响。
　　方法:成年SD大鼠72只，分为假手术组、股动脉结扎组、DETANONOate(NO供体)组、L-NAME(NOS抑制剂)组。DETA NONOate组、L-NAME组动物分别在股动脉结扎基础上腹腔注射DETANONOate和L-NAME，各组动物存活1周后，结合共聚焦免疫荧光组织化学方法、EB和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluoresceinisothiocyanate-dextran，FITC-dextran)通透性实验等，观察DETANONOate和L-NAME对股动脉结扎诱导的侧支血管生长及血管VE-cadherin、eNOS、iNOS表达和通透性的影响，检测侧支血管生长的主要指标有侧支血管的增殖(Ki67)、炎症细胞的浸润(CD11b)和eNOS、iNOS的表达变化等。
　　结果:动物存活1周后，与单纯股动脉结扎组比较，给予DETANONOate后，侧支血管Ki67阳性细胞率增加，VE-cadherin在内膜表达减少，呈不连续状，形成间隙，血管EB渗出量和巨噬细胞(CD11b阳性)增加，在侧支血管可见FITC-dextran渗出增加;而给予L-NAME后，侧支血管Ki67阳性细胞率和eNOS、iNOS表达减少，VE-cadherin在内膜表达增加，呈连续分布，血管EB、FITC-dextran渗出和CD11b表达减少;单纯股动脉结扎组可见CD11b阳性细胞、eNOS、iNOS表达、EB和FITC-dextran渗出较假手术组增加。
　　结论:①大鼠股动脉结扎诱导的侧支血管生长过程中，eNOS和iNOS表达增加，血管通透性增加，侧支血管有炎症细胞浸润。②外源性增加NO水平，可通过抑制VE-cadherin的表达和破坏细胞粘附连接以增强血管通透性，从而加速侧支血管炎症细胞的形成，促进血管细胞增殖和侧支血管生长。而NOS抑制剂则通过抑制eNOS、iNOS表达，使内源性NO合成减少，可通过增加VE-cadherin的表达和稳定粘附连接结构，从而降低血管通透性和阻止侧支血管炎症形成，使得侧支血管生长受抑制。
　　第三部分 NO/NOS对体外培养血管内皮细胞VE-cadherin的表达、细胞增殖和通透性的影响
　　目的:用药物改变培养液中NO水平，研究其对内皮细胞增殖、VE-cadherin、eNOS表达和通透性的影响，以进一步阐明NO对血管内皮细胞的作用及在侧支血管生长中的可能作用机制。
　　方法:对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells，HUVEC)进行NO供体(DETA NONOate)或NOS抑制剂(L-NAME)干预后，用Griess法检测细胞培养液中NO产物的浓度，MTT比色法检测内皮细胞的活性，免疫荧光细胞化学和蛋白印迹(Western blot)法检测HUVEC增殖活性、eNOS和VE-cadherin的表达;Transwell通透性实验检测内皮细胞通透性的变化。
　　结果:加入1、10、100μmol/L DETA NONOate后，NO产物浓度和细胞通透性较对照组明显增加，两者均随着DETA NONOate浓度增加呈剂量依赖性增加趋势;而加入10、100、1000μmol/L L-NAME后NO产物浓度和细胞通透性较对照组减低(P＜0.01)，两者均随着L-NAME浓度增加呈剂量依赖性减少趋势。10μmol/L DETA NONOate作用后HUVEC细胞Ki67的表达和细胞活性增加、VE-cadherin表达减少，部分呈断续状分布，细胞间有少量间隙;而加入100μmol/LL-NAME作用后，HUVEC细胞eNOS、Ki67的表达和细胞活性明显减低，VE-cadherin表达上调，在细胞连接处可见较强的表达。
　　结论:①外源性增加NO引起VE-cadherin表达减少及内皮细胞通透性增加;抑制eNOS表达和NO合成，HUVEC细胞VE-cadherin的表达增加及通透性降低;②NO能促进血管内皮细胞增殖。

目录

声明

摘要

符号说明

1 绪论

2 股动脉结扎诱导的侧支血管生长、VE-cadherin表达和通透性变化

2．1 材料和方法

2．1．1 试剂及设备

2．1．2 实验动物分组及动物模型

2．1．3 取材、保存与切片

2．1．4 血管造影

2．1．5 苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，H．E．染色)

2．1．6 VE-cadherin、Ki67的免疫荧光组织化学染色

2．1．7 血管通透性实验

2．1．8 结果观察

2．1．9 数据分析

2．2 实验结果

2．2．1 血管造影结果

2．2．2 H．E．染色结果

2．2．3 股动脉结扎后诱导的侧支血管的增殖情况

2．2．4 股动脉结扎后诱导的侧支血管VE-cadherin表达的变化

2．2．5 股动脉结扎后诱导的侧支血管通透性的变化

2．3 讨论

2．3．1 股动脉结扎诱导的侧支血管生长

2．3．2 股动脉结扎诱导的侧支血管生长过程中VE-cadherin表达和通透性变化

3 NO／NOS对侧支血管生长过程中VE-cadherin表达和通透性的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 试剂及设备

3．1．2 实验动物分组及动物模型

3．1．3 血管通透性实验

3．1．4 取材与切片

3．1．5 VE-cadherin、eNOS、iNOS、Ki67、CD11b、CD31的免疫荧光组织化学染色

3．1．6 结果观察

3．1．7 数据分析

3．2 实验结果

3．2．1 NO供体和NOS抑制剂对侧支血管增殖的影响

3．2．2 NO供体和NOS抑制剂对侧支血管炎症的影响

3．2．3 NOS抑制剂对侧支血管eNOS、iNOS的影响

3．2．4 NO供体和NOS抑制剂对侧支血管VE-cadherin的影响

3．2．5 NO供体和NOS抑制剂对血管通透性的影响

3．3 讨论

3．3．1 NOS在股动脉结扎诱导的侧支血管中的表达

3．3．2 NO／NOS对侧支血管VE-cadherin表达、通透性的影响

3．3．3 NO／NOS—VE-cadherin—通透性通路在侧支血管生长过程中对单核细胞／巨噬细胞的浸润的影响

4 NO／NOS对体外培养血管内皮细胞VE-cadherin的表达、细胞增殖和通透性的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 实验试剂、材料和设备

4．1．2 细胞传代培养及鉴定

4．1．3 实验分组及处理

4．1．4 NO产物浓度的测定

4．1．5 体外HUVEC细胞通透性实验

4．1．6 MTT比色法检测内皮细胞活性的影响

4．1．7 免疫荧光细胞化学染色

4．1．8 Western Blot检测HUVEC细胞VE-cadherin、eNOS的表达

4．1．9 数据收集

4．1．10 统计学分析

4．2 实验结果

4．2．1 传代的HUVEC细胞形态和鉴定结果

4．2．2 NO产物检测结果

4．2．3 DETA NONOate和L-NAME对HUVEC细胞通透性的影响

4．2．4 MTT比色法检测HUVEC细胞的活性结果

4．2．5 DETA NONOate和L-NAME对HUVEC细胞Ki67表达的影响

4．2．6 L-NAME抑制HUVEC细胞eNOS表达

4．2．7 DETA NONOate、L-NAME对HUVEC细胞VE-cadherin表达的影响

4．3 讨论

4．3．1 NO／NOS对血管内皮细胞VE-cadherin表达的影响

4．3．2 NO／NOS对血管内皮细胞增殖的影响

5 结论

参考文献

综述 细胞连接与血管重塑的研究进展

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢