NOR1是调节肿瘤细胞自噬/凋亡分子开关的氧化应激反应性蛋白

摘要

NOR1是本实验室自主克隆的鼻咽癌易感基因，在鼻咽癌组织中显著下调，但其下调机制和转录调控规律尚未阐明。NOR1蛋白定位于线粒体和胞浆中，与OSCP蛋白存在直接交互作用;NOR1表达抑制鼻咽癌细胞的生长与增殖，并促进缺氧引起的细胞凋亡。但该基因在肿瘤发生发展中的作用及机制研究的还未成熟。本研究主要内容包括：
　　⑴定位克隆NOR1基因的核心启动子。采用预测软件PromoterScan、PromoterInspector和EMBOSS CpGPlot综合分析发现，NOR1基因启动子区可能位于转录起始位点(为+1)上游-517bp至下游+236bp以内。为了确定NOR1基因核心启动子序列，将NOR1基因的预测启动子调控区分为几段，构建出一系列NOR1基因不同调控区荧光素酶报告载体和绿色荧光蛋白报告载体。通过luciferase assay和荧光显微镜观察联合分析，发现NOR1核心启动子定位于NOR1基因5'端-258/+26区间内。
　　⑵NOR1基因启动子区存在一个典型的CpG岛，在鼻咽癌组织和细胞中因启动子高甲基化修饰而表达下调。MatInspector软件分析发现NOR1基因启动子区序列无TATA盒和CAAT盒，GC含量高达58.8％，为一典型的CpG岛，提示NOR1启动子转录活性可能受到甲基化的影响。采用SssI甲基化酶体外甲基化修饰NOR1启动子报告载体，通过荧光素酶报告系统及绿色荧光蛋白报告系统检测发现，甲基化使NOR1启动子彻底丧失转录活性。进一步联合BSP和MSP两种经典甲基化检测方法分别对鼻咽癌组织、细胞及鼻咽正常上皮组织和细胞中NOR1的启动子甲基化状态进行检测，结果发现NOR1启动子在鼻咽癌组织、细胞系中呈不同程度的高甲基化状态，其中NOR1启动子在HSF1、NRF1结合部位含有CG位点，在鼻咽癌组织和细胞系中发生甲基化修饰，而在正常鼻咽组织或鼻咽上皮细胞系中呈完全非甲基化状态。免疫组化和RT-PCR检测发现，鼻咽癌组织和细胞系中NOR1 mRNA和蛋白水平明显下调。采用甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理NOR1启动子高甲基化细胞HL60和6-10B，RT-PCR及实时荧光定量PCR方法检测发现，5-Aza-CdR可以改变细胞中NOR1启动子的甲基化状态并恢复NOR1基因mRNA的表达。结果表明NOR1启动子的甲基化状态与其表达水平密切相关，启动子甲基化是使NOR1在鼻咽癌中表达下调的重要机制。
　　⑶应激相关转录因子HSF1和NRF1共同正向调控NOR1基因启动子活性。采用转录因子预测软件MatInspector预测NOR1基因启动子区潜在的转录因子结合位点，结果显示在NOR1基因启动子区可能存在与应激密切相关的两个转录因子--热休克因子HSF1、核呼吸因子NRF1的结合位点。通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀技术(ChIP)证实HSF1和NRF1两个转录因子确实能与NOR1核心启动子序列特异性结合。进一步运用荧光素酶报告载体分析系统研究发现，转录因子HSF1蛋白能够增强细胞内NOR1启动子活性;Western blot检测发现瞬时转染HSF1和NRF1能够上调Hela细胞内NOR1蛋白表达水平;采用shRNA慢病毒感染293细胞，干扰HSF1或NRF1表达，通过PCR检测发现NOR1 mRNA表达下调。以上结果均显示，转录因子HSF1、NRF1能够促进NOR1基因的转录。
　　⑷H2O2可以诱导鼻咽上皮细胞及恶性肿瘤细胞中NOR1基因的表达。HSF1和NRF1能参与氧化应激调控，据此推测NOR1可能与氧化应激有关。采用H2O2处理鼻咽上皮细胞系NP69和乳腺癌细胞系MCF7，诱导氧化应激，通过实时荧光定量PCR、免疫荧光结合流式细胞分析证实，H2O2能够诱导鼻咽上皮细胞系NP69和乳腺癌细胞系MCF7中NOR1的表达，因此认为NOR1是一个氧化应激反应性蛋白。
　　⑸NOR1抑制肿瘤细胞自噬，影响能量代谢并抑制肿瘤细胞生长。采用已建立的NOR1稳定表达HNE1细胞株，通过生长曲线实验发现，NOR1抑制了鼻咽癌细胞HNE1的生长和增殖，软琼脂集落形成实验发现，NOR1明显抑制HNE1细胞的集落形成能力和增殖;而在NOR1表达相对较高的宫颈癌细胞HeLa中，干扰NOR1促进了HeLa的生长和增殖。电镜图片、Western blot等技术检测发现，过表达NOR1能够有效地抑制肿瘤细胞中基础水平的自噬行为，而在NOR1表达相对较高的HeLa细胞中使用RNAi干扰技术敲除NOR1的表达则能增强细胞内自噬水平。细胞自噬与肿瘤细胞能量代谢密切相关。乳酸生存率及葡糖糖消耗实验发现，NOR1基因能够抑制肿瘤细胞中活跃的糖酵解。氧耗量及DCFH-DA方法检测发现，NOR1表达可以降低鼻咽癌细胞线粒体呼吸水平及细胞内ROS的水平。
　　⑹NOR1增强了氧化应激状态下细胞毒性，降低了细胞活力;NOR1抑制细胞自噬水平，促进氧化应激状态下的细胞凋亡。前期研究证实NOR1是一个氧化应激性蛋白，于是我们设想该基因在氧化应激状态下对肿瘤细胞是否产生影响。使用H2O2处理过表达NOR1的恶性鼻咽癌细胞NOR1/HNE1及对照细胞系Ctrl/HNE1，利用LDH技术及MTT方法检测发现，在肿瘤细胞中过表达NOR1会引起H2O2引起的细胞毒性的增加，以及细胞活力的减弱。于是进一步研究NOR1调节氧化应激引发的细胞毒性是否通过影响细胞在氧化应激状态的下的细胞自噬水平来实现。通过电子显微镜观察及Western blot检测发现，过表达NOR1显著地抑制了鼻咽癌细胞中的氧化应激状态下的自噬水平;而siRNA干扰NOR1后则增强了细胞内的自噬。通过TUNEL、Hoechst33258染色及电镜观察等方法检测发现，NOR1促进了鼻咽癌细胞系HNE1中的细胞凋亡水平;相反，siRNA干扰NOR1后降低了对氧化应激诱导的凋亡敏感性。进一步分离细胞线粒体蛋白及胞浆蛋白，检测发现NOR1的表达增加了氧化应激状态下线粒体膜的通透性，促进了H2O2诱导的凋亡细胞中Smac/Diablo向胞浆中的释放，进而激活了caspase-9、caspase-3和PARP，激活了线粒体途径的细胞凋亡。
　　⑺NOR1显著增强肿瘤细胞的化疗敏感性。研究发现，自噬的激活可能是一个抵抗化疗药物的保护机制，因此我们设想NOR1是否能增加肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性呢？于是使用经典鼻咽癌化疗药物顺铂处理过表达NOR1的鼻咽癌细胞NOR1/5-8F和对照组细胞Ctrl/5-8F，MTT实验发现NOR1显著增加了肿瘤细胞中顺铂的细胞毒性。Western blot及Hoechst33258染色检测发现NOR1也抑制了顺铂诱导的自噬，促进了顺铂诱导细胞凋亡，增强了肿瘤细胞的化疗敏感性。以上结果在HNE1细胞中也得到了验证。总之，抑癌基因的高甲基化异常修饰在鼻咽癌的发生发展中发挥了重要的作用，通过对鼻咽癌组织中NOR1甲基化状态的检测，明确了其在鼻咽癌中下调的分子机制，为鼻咽癌的早期诊断和预后分析提供了实验依据。同时，以上结果为抑癌基因NOR1在鼻咽癌中对细胞自噬和细胞凋亡的调节提供了新的实验依据，并提示NOR1可能是一个治疗肿瘤的新靶点。

目录

声明

摘要

主要缩略词简表

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞系和组织样本

2．1．2 菌株和质粒载体

2．1．3 试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 生物信息学分析

2．2．2 基因组DNA的提取

2．2．3 胶回收(按试剂盒说明书步骤进行)

2．2．4 转化反应

2．2．5 载体的构建

2．2．6 质粒、siRNA转染目的细胞

2．2．7 慢病毒转染目的细胞

2．2．8 核心启动子检测

2．2．9 甲基转移酶Sss I处理DNA

2．2．10 凝胶迁移率实验(EMSA)

2．2．11 染色质免疫共沉淀实验ChIP检测

2．2．12 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰

2．2．13 亚硫酸氢钠测序法(Bisulfite Genomic Sequencing，BGS)

2．2．14 甲基化特异性PCR(Methylated specific PCR，MSP)

2．2．15 组织及细胞RNA制备及cDNA的转录

2．2．16 差异RT-PCR

2．2．17 细胞蛋白制备

2．2．18 Western blot检测

2．2．19 免疫荧光实验

2．2．20 流式细胞术检测基因蛋白表达水平

2．2．21 肿瘤细胞生长实验

2．2．22 软琼脂集落生成实验

2．2．23 MTT法检测细胞活力

2．2．24 MTT法检测药物对细胞毒性的IC50

2．2．25 LDH法测量细胞毒性

2．2．26 TUNEL技术检测细胞凋亡

2．2．27 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

2．2．28 乳酸生成实验

2．2．29 耗氧量检测

2．2．30 ROS检测

2．2．31 统计学分析

3 结果

3．1 NOR1的转录调控规律及氧化应激敏感性表达

3．1．1 NOR1基因启动子的定位及克隆

3．1．2 NOR1基因在鼻咽癌中甲基化沉默

3．1．3 NOR1基因启动子区域的转录调控机制及氧化应激敏感性表达

3．2 NOR1基因重要生物学功能

3．2．1 NOR1基因抑制恶性肿瘤细胞生长和增殖

3．2．2 NOR1基因抑制恶性肿瘤细胞自噬分子表达和自噬行为

3．2．3 NOR1表达抑制肿瘤细胞的能量代谢

3．3 NOR1基因对细胞自噬／凋亡氧化应激敏感性的调节

3．3．1 NOR1增加氧化应激状态下细胞毒性，降低细胞活力

3．3．2 NOR1通过抑制氧化应激诱导的细胞自噬，促进细胞凋亡

3．3．3 NOR1增加化肿瘤细胞的化疗敏感性

4 讨论

4．1 抑癌基因NOR1是一个在鼻咽癌中甲基化沉默的氧化应激反应性蛋白

4．1．1 抑癌基因NOR1启动子在鼻咽癌中甲基化沉默

4．1．2 抑癌基因NOR1是一个氧化应激反应性蛋白，功能与氧化应激相关

4．2 抑癌基因NOR1的生物学功能

4．2．1 抑癌基因NOR1同时抑制肿瘤生长和自噬

4．2．2 抑癌基因NOR1通过抑制自噬来抑制肿瘤细胞能量代谢，发挥抑癌的作用

4．3 抑癌基因NOR1通过抑制细胞自噬，促进氧化应激诱导的肿瘤细胞凋亡

4．4 抑癌基因NOR1通过线粒体凋亡途径促进氧化应激诱导的肿瘤细胞凋亡

4．5 抑癌基因NOR1与顺铂协同抑制自噬，增强鼻咽癌细胞对顺铂的化疗敏感性

结论

参考文献

综述 ROS调控自噬的分子机制研究

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢