三氧化二砷对急性哮喘小鼠CD4+T细胞凋亡的影响及机制研究

摘要

本文从以下三部分进行了论述。
　　第一章三氧化二砷对急性哮喘小鼠气道高反应性及气道炎症的影响。
　　目的：
　　(1)建立急性哮喘小鼠模型，并鉴定建立的模型是否成功;
　　(2)观察三氧化二砷对急性哮喘小鼠气道高反应性及气道炎症的影响。
　　方法：
　　将30只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为三组:正常组(PBS组)、哮喘组（OVA/PBS组）和三氧化二砷组（OVA/ATO组），每组10只。所有小鼠适应性饲养一周后按以下方法建立急性哮喘小鼠模型。PBS组于第1、13天经腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml，第19-24天连续6天每天予以6ml PBS缓冲液(PH7.2-7.4)雾化30min，每次雾化前30min予以腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml;OVA/PBS组于第1、13天经腹腔注射OVA与氢氧化铝凝胶的混合溶液(10μg OVA(GradeV)和2mg氢氧化铝凝胶溶于PBS缓冲液中，充分混匀）0.2ml，第19-24天连续6天每天予以5％OVA(GradeV)溶液6ml雾化30min，每次雾化前30min予以腹腔注射PBS缓冲液(PH7.2-7.4)0.2ml; OVA/ATO组于第1、13天腹腔注射OVA与氢氧化铝凝胶的混合溶液(10μg OVA(GradeV)和2mg氢氧化铝凝胶溶于PBS缓冲液中，充分混匀）0.2ml，第19-24天连续6天每天予以5％OVA(GradeV)溶液6ml雾化30min，每次雾化前30min予以腹腔注射三氧化二砷溶液（用量:2.5mg/kg×小鼠体重，配成0.2ml溶液）。第25天处理所有小鼠，检测以下指标:(1)对小鼠的一般行为活动进行观察;(2)不同浓度的乙酰甲胆碱激发小鼠后，采用有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性;(3)收集BALF行细胞计数及分类;(4)肺组织病理切片观察炎症细胞浸润及黏液分泌情况。计量资料以均数±标准差((x)±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验，如果数据不符合正态分布，则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐，则行Dunnett's T3法。多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysisof Variance，ANOVA)，各组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　实验前:各组小鼠的外观、行为、对刺激的反应、活动及体重均无明显差异。致敏阶段:各组小鼠的腹腔注射部位无红肿、溃烂。激发阶段:PBS组小鼠饮食正常，活动灵敏，皮毛清洁有光泽，OVA/PBS组小鼠早期出现兴奋、打喷嚏、抓耳挠腮，后期出现匍匐不起、嗜睡症状，OVA/ATO组小鼠出现打喷嚏、兴奋的症状较OVA/PBS组轻，无嗜睡症状。而且，实验全程OVA/ATO组小鼠没有活动减少、厌食、体重减轻等异常症状。
　　OVA/PBS组小鼠气道反应性较PBS组显著增高(P＜0.05);而OVA/ATO组小鼠气道反应性较OVA/PBS组明显降低(P＜0.05)。
　　OVA/PBS组小鼠BALF中白细胞总数为21.11±3.28×104/ml、嗜酸性粒细胞数为3.10±0.50×104/ml、淋巴细胞数为6.60±0.97×104/ml、中性粒细胞数为4.92±0.45×104/ml，较PBS组均显著增加（均P＜0.01）;OVA/ATO组BALF中自细胞总数为13.04±2.58×104/ml、嗜酸性粒细胞数为1.06±0.19×104/ml、淋巴细胞数为2.43±0.28×104/ml、中性粒细胞数为2.36±0.29×104/ml，较OVA/PBS组均明显降低（均P＜0.01）。
　　与PBS组相比，OVA/PBS组小鼠肺组织大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道分泌大量黏液(P＜0.01);OVA/ATO组气道炎症和黏液分泌状态较OVA/PBS组有所减轻(P＜0.05)。
　　结论：
　　(1)本实验中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的;
　　(2)三氧化二砷能减轻急性哮喘小鼠的气道高反应性及气道炎症。
　　第二章三氧化二砷诱导急性哮喘小鼠CD4+T细胞凋亡。
　　目的：
　　检测三氧化二砷干预对急性哮喘小鼠CD4+T细胞凋亡的影响。
　　方法：
　　在体部分:将18只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为三组:正常组(PBS组)、哮喘组（OVA/PBS组）和三氧化二砷组(OVA/ATO组)，每组6只，按第一章中的方法建立急性哮喘小鼠模型，第25天处理小鼠，利用免疫磁珠分离纯化各组小鼠脾CD4+T细胞，计数CD4+T细胞总数，然后用完全性RPMI-1640培养基按2×106cell/ml的浓度接种细胞，同时加入ConA（5ug/ml）进行刺激，置于培养箱中培养24h，用流式细胞术检测细胞的凋亡率。
　　离体部分:免疫磁珠分离纯化OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞，然后用完全性RPMI-1640培养基按2×106cell/ml的浓度接种细胞，加入ConA(5ug/ml)进行刺激，同时分别加入四组不同浓度的三氧化二砷溶液(0μM，1μM，3μM，5μM)培养20小时，用流式细胞术检测细胞的凋亡率。计量资料以均数±标准差((x)±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验，如果数据不符合正态分布，则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐，则行Dunnett's T3法。多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)，各组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　在体部分:OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞总数为(17.88±2.13)×108/L，较PBS组显著增多(P＜0.01); OVA/ATO组小鼠脾CD4+T细胞总数为(12.92±2.31)×108/L，较OVA/PBS组显著减少(P＜0.05)。OVA/PBS组CD4+T细胞的凋亡率为20.69±2.68％，较PBS组显著下降(P＜0.05);OVA/ATO组CD4+T细胞的凋亡率为34.71±0.98％，较OVA/PBS组显著升高(P＜0.05)。
　　离体部分:3μM组CD4+T细胞的凋亡率为31.85±3.73％，较0μM组显著升高(P＜0.05);5μM组CD4+T细胞的凋亡率为40.54±1.99％，较0μM组和3μM组均显著升高(P＜0.01和P＜0.05)。
　　结论：
　　三氧化二砷诱导急性哮喘小鼠CD4+T细胞的凋亡。
　　第三章内质网应激-CHOP途径参与三氧化二砷诱导CD4+T细胞的凋亡。
　　目的：
　　(1)探讨三氧化二砷干预对CD4+T细胞GRP78和CHOP蛋白表达的影响;
　　(2)探索CHOP蛋白在三氧化二砷诱导CD4+T细胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　第一部分:、免疫磁珠分离纯化第一章中已建模成功的OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞，体外加入5μM三氧化二砷，分别培养0h，2.5h，5h，7.5h后，检测蛋白GRP78、CHOP的表达。
　　第二部分:将OVA/PBS组小鼠脾CD4+T细胞分成两组:CHOP siRNA组和control siRNA组。首先，用可以沉默CHOP表达的CHOP siRNA和无沉默效果的对照片段contol siRNA分别转染两组CD4+T细胞，转染成功后，用real-timePCR和western blot分别检测两组CHOP mRNA和蛋白的表达，评估siRNA的沉默效果，达到满意效果后加入5μM三氧化二砷培养20h，检测各组细胞的凋亡率。
　　计量资料以均数±标准差((x)±S)表示。各组数据先行正态检验和方差齐性检验，如果数据不符合正态分布，则经自然对数转换为正态分布的数据。若数据方差不齐，则行Dunnett's T3法。两组均数间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA)，各组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　ATO干预2.5h组，5h组，7.5h组GRP78蛋白的相对表达量较0h组均显著增多（分别是P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）;5h组GRP78蛋白的相对表达量较2.5h组和7.5h组均显著升高（均P＜0.05）;而2.5h组GRP78蛋白的相对表达量与7.5h组之间未见明显组间差异(P＞0.05)。
　　ATO干预5h组CHOP蛋白的相对表达量较0h组、2.5h组和7.5h组均显著增多（均P＜0.05）;
　　CHOP siRNA组CHOP mRNA和蛋白的表达量较control siRNA组均显著下降（均P＜0.01）;
　　予以ATO干预后CHOP siRNA组CD4+T细胞的凋亡率为32.39±2.30％，较control siRNA组显著下降(P＜0.05)。
　　结论：
　　(1)三氧化二砷能影响CD4+T细胞中GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达;
　　(2)转染CHOP siRNA能沉默CHOP蛋白的表达，并能部分阻断三氧化二砷诱导的CD4+T细胞的凋亡;
　　(3)内质网应激-CHOP途径参与三氧化二砷诱导的CD4+T细胞的凋亡。