Effects of alkaloid sinomenine on the activity of ERK1/2 and proliferation of CD4+T lymphocytes of human peripheral blood in vitro

摘要

目的:通过青藤碱(Alkaloid sinomenine,SIN)对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性及增殖率影响的体外研究,探讨SIN对人外周血CD4+T细胞免疫抑制作用效应及可能分子生物学机制,为SIN在器官移植领域中的临床应用提供理论依据。
　　方法:在衡阳市中心血站抽取3名健康人肘静脉血50ml,肝素(10U/ml)抗凝。用淋巴细胞分离液从血液标本中分离PBMC,并制成PBMC悬液,通过免疫磁珠分离法从PBMC悬液中分选CD4+T细胞,将CD4+T细胞用10％FCS RPMI-1640完全培养液在37℃、5%CO2条件下培养,CD4+T细胞经终浓度为5ug/ml的PHA和终浓度为100U/ml的IL-2扩增7天,将扩增后的的细胞用PBS洗3遍,继续培养(细胞培养液中不含rIL-2和PHA)1天,细胞接种于中方瓶,生长至70%-80%时(对数生长期),各组细胞培养液中加入终浓度1ug/ml的鼠抗人CD3单克隆抗体,继续培养6小时后,每人细胞均分为3等份,分别作以下处理:(一)ERK1/2活性检测。以P-EIk-1蛋白表达水平反映ERK1/2活性:(1)不同浓度SIN对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性的影响:1)细胞培养液中加入不含任何药物但与实验组等量的SIN稀释液,2)细胞培养液中分别加入终浓度为10、200、1000umol/L的SIN溶液,3)细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA,4)细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA和200umol/L的SIN溶液,分别作用细胞2小时;(2)相同浓度SIN不同作用时间对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性的影响:1)0min组:细胞培养液中加入不含任何药物但与实验组等量的SIN稀释液,2)细胞培养液中加入终浓度为1000umol/L的SIN溶液,分别作用15min,30min,1h,1.5h,2h;(二)SIN对人外周血CD4+T细胞增殖率的影响:MTT比色法检测细胞增殖率。
　　结果:一(1)非放射免疫沉淀法检测不同浓度SIN对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性的影响:应用UVP凝胶图像采集系统 X线胶片上的条带进行灰度扫描,以其平均光密度值大小反应信号的相对强弱,即相对的表达量的大小:空白对照组:2.50±0.08,CsA组:2.47±0.05, CsA+SIN组:0.65±0.19,低浓度SIN组:2.42±0.04,中浓度SIN组:1.37±0.34,高浓度SIN组:0.75±0.22。经单向方差分析,低浓度SIN组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),CsA组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),其余各组相互比较均有显著性差异(P<0.05);经相关性分析,SIN的浓度与人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性之间存在负相关;本实验还证实,CsA对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性无明显影响,CsA+SIN组的细胞光密度值比单独CsA组和各浓度SIN组都低,差异有显著性(P<0.05),这提示我们,虽然CsA本身对人外周血CD4+T细胞 ERK1/2活性无明显影响,但CsA可协同SIN降低人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性。一(2)、相同浓度SIN不同作用时间对人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性的影响:平均光密度值大小:0min组:2.58±0.18,15min组:2.56±0.16,30min组:1.56±0.27,1h组:1.05±0.31,1.5h组:0.74±0.17,2h组:0.65±0.15。经单向方差分析,15min组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),其余各组之间相互比较均有显著性差异(P<0.05),2h组灰度值最低,与各组比较均有显著差异(P<0.05);经相关性分析,SIN降低人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性与SIN作用时间有关。二、MTT比色法检测CD4+T细胞增殖率的结果:经药物处理30小时后,以MTT比色法测定各组CD4+T细胞OD值:空白对照组:0.87±0.21,CsA组:0.36±0.20,低浓度SIN组:0.80±0.11,中浓度SIN组:0.59±0.15,高浓度SIN组:0.54±0.14,CsA+SIN组:0.31±0.17。经单向方差分析,低浓度 SIN组与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),其余各组之间相互比较均有显著性差异(P<0.05);经相关性分析,SIN的浓度与人外周血CD4+T细胞增殖抑制率之间存在正相关,本实验还证实,CsA对人外周血CD4+T细胞增殖有明显抑制作用,CsA+SIN组的细胞光吸收值比单独CsA组和各浓度SIN组都低,差异有显著性(P<0.05),这提示我们, CsA与SIN有协同抑制CD4+T细胞增殖的作用。
　　结语:SIN能浓度依赖性地降低人外周血CD4+T细胞ERK1/2活性;相同浓度SIN降低人外周血CD4+T细胞通路ERK1/2活性与SIN作用时间有关;SIN对人外周血CD4+T细胞增殖抑制率与浓度之间存在显著性正相关;它有潜力成为移植免疫抑制药物的新成员。

目录

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

第二章 材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

第三章 结果

一、不同浓度SIN对CD4+T细胞ERK1/2活性的影响

二、相同SIN浓度不同作用时间对CD4+T细胞ERK1/2活性的影响

三、MTT比色法检测细胞增殖的结果

第四章 讨论

一、人外周血CD4+T细胞模型的建立

二、青藤碱的免疫抑制作用

三、展望

第五章 结论

参考文献

综述

读研期间发表的论文

致谢