PCSK9siRNA抑制ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症因子表达与分泌

摘要

研究背景：
　　近年来,大量的研究表明动脉粥样硬化是一种慢性炎症性病理过程。动脉粥样硬化病变中不仅含有大量的脂质,而且有大量的炎症细胞浸润,并以单核/巨噬细胞和淋巴细胞的集聚为特征。动脉粥样硬化发生、发展中,这些炎症细胞可分泌大量的炎症因子,参与调节细胞的增殖或凋亡、细胞外基质的合成或降解以及血管的重塑等过程。
　　PCSK9是2003年应用生物信息学方法和DNA微阵列技术发现的一个与血液胆固醇代谢调节相关的基因,最近的研究表明,PCSK9作为一种分泌性蛋白,除了降解LDLR,调节胆固醇代谢之外,可能还具有其他的一些生物学功能。我们前期研究发现PCSK9在兔动脉粥样硬化斑块以及THP-1源性巨噬细胞中高表达,LDL和ox-LDL都可以上调PCSK9在THP-1源性巨噬细胞中的表达。靶向PCSK9的RNA干扰能有效抑制ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡作用,这提示ox-LDL在巨噬细胞中的生物学效应可以被PCSK9所影响。ox-LDL诱导巨噬细胞中炎症因子的表达与分泌是 ox-LDL的重要生物学效应之一,研究PCSK9是否也能干预炎症因子的表达与分泌具有重要的科学意义。
　　目的：
　　观察PCSK9 siRNA对ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞分泌炎症因子的影响,为阐明PCSK9在动脉粥样硬化中的作用提供实验依据。
　　材料与方法：
　　用不同浓度的ox-LDL(0,10,20,40,80μg/ml)处理经PMA诱导贴壁的THP-1源性巨噬细胞不同时间(0h,6h,12h,24h,48h),RT-PCR、ELISA、Western Blot分别检测炎症因子 IL-1α、IL-6、TNF–α以及 PCSK9 mRNA和蛋白的表达。应用Lipofectamine2000转染不同浓度的PCSK9 siRNA(20nmol/l,40nmol/l,80nmol/l)进入THP-1源性巨噬细胞24h,筛选出最有效的siRNA浓度,将此浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞24h后,再加入ox-LDL处理24 h,RT-PCR、ELISA、Western Blot检测炎症因子IL-1α、IL-6、TNF–α表达以及NF-κB核位移。
　　结果：
　　随着ox-LDL浓度的不断增加THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-1α、IL-6及TNF–α mRNA和蛋白的表达逐渐增加,同时 RT-PCR、Western Blot检测发现PCSK9 mRNA、蛋白表达均增高。PCSK9 siRNA转染THP-1细胞后,再用ox-LDL处理,RT-PCR、ELISA、Western Blot检测发现与ox-LDL单独处理组相比,IL-1α、IL-6、TNF–αmRNA和蛋白表达都降低并且NF-κB核位移减少。
　　结论：
　　PCSK9 siRNA能够抑制 ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-1α、IL-6和TNF-α表达与分泌,其机制与抑制NF-κB核位移有关,提示PCSK9可能参与了炎症反应的调节。

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中文摘要

英文摘要

前言

实验材料

1细胞和主要试剂

2主要仪器与器材

实验方法

1 细胞培养

2逆转录-聚合酶链反应

2.1细胞总RNA的提取

2.2逆转录反应

2.3聚合酶链反应

2.4电泳分析

2.5结果判断

3 ELISA

3.1样品收集

3.2ELISA检测

3.3 结果判断

4 Western Blot

4.1蛋白的提取

4.2 SDS-PAGE凝胶电泳

4.3转膜

4.4封闭及孵育抗体

4.5化学发光鉴定

4.6结果判断

5 PCSK9 siRNA 设计制备

6 脂质体介导细胞转染

7 荧光显微镜检测siRNA的转染效率

8 图像分析和统计学处理

实验结果

1 ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞炎症因子表达的影响

1.1 ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-1αmRNA和蛋白表达的影响

1.2 ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-6 mRNA以及蛋白表达的影响

1.3 ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞炎症因子TNF-αmRNA以及蛋白表达的影响

2 ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞PCSK9表达的影响

3荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)转染的结果鉴定

4 PCSK9 siRNA对THP-1 源性巨噬细胞PCSK9表达的影响

5. PCSK9 siRNA 对THP-1 源性巨噬细胞炎症因子表达的影响

5.1 PCSK9 siRNA 对THP-1源性巨噬细胞IL-1α mRNA以及蛋白表达的影响

5.2 PCSK9 siRNA 对THP-1源性巨噬细胞IL-6 mRNA以及蛋白表达的影响

5.3 PCSK9 siRNA 对THP-1源性巨噬细胞TNF-αmRNA以及蛋白表达的影响

6. PCSK9 siRNA对THP-1源性巨噬细胞NF-κB核位移的影响

讨论

结论

参考文献

主要英文缩略语索引

综述

硕士期间发表的文章

致谢