HCV核心蛋白对Huh7细胞Wnt/β-Catenin/TCF信号通路及细胞凋亡的影响

摘要

目的：
　　研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)1b基因型核心蛋白（core）对Huh7细胞Wnt/β-catenin/TCF信号通路及细胞凋亡的影响，以初步探索1b基因型 HCV核心蛋白与Wnt/β-catenin/TCF信号通路及细胞凋亡的关系。
　　方法：
　　通过脂质体介导将重组后的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HCV-1b-core瞬时转染Hun7细胞（pcDNA3.1(-)-C组），RT-PCR及Western Blot检测其mRNA和蛋白的表达；MTT、RT-PCR、Western Blot、双荧光素酶报告系统分别检测成功转染pcDNA3.1(-)/HCV-1b-core后Huh7细胞的增殖、β-catenin mRNA和蛋白的表达，以及TCF转录因子活性；流式细胞术和Western Blot分别检测血清饥饿诱导条件下成功转染pcDNA3.1(-)/HCV-1b-core Huh7细胞的凋亡和Caspase-3的表达；以转染空质粒的pcDNA3.1(-)组、空白对照组Huh7细胞作为对照。
　　结果：
　　1、重组质粒pcDNA3.1(-)/HCV-1b-core瞬时转染Huh7细胞，成功表达HCV core相关mRNA和蛋白。
　　2、相同条件下，取12h、24h、36h、48h、60h、72h六个时间点MTT检测发现，24h、36h、48h、60h、72h时间点pcDNA3.1(-)-C组Huh7细胞生长活力明显高于pcDNA3.1(-)组和空白对照组细胞（P<0.01），pcDNA3.1(-)组和空白对照组细胞生长活力无明显差别（P>0.05）。
　　3、成功转染HCV core基因的pcDNA3.1(-)-C组huh7细胞β-catenin mRNA和相关蛋白相对表达量增高，与pcDNA3.1(-)组和空白对照组细胞比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
　　4、pcDNA3.1(-)-C组 pTOPFLASH荧光素酶相对活性明显高于本组pFOPFLASH荧光素酶相对活性，同时高于 pcDNA3.1(-)组和空白对照组pTOPFLASH荧光素酶相对活性，差异有统计学意义（P＜0.01）；而pcDNA3.1(-)组和空白对照组pTOPFLASH和pFOPFLASH荧光素酶相对活性互相对比均无明显差别（P>0.05）。
　　5、血清饥饿诱导凋亡后，Western Blot检测发现pcDNA3.1(-)-C组Caspase-3相对表达量明显低于pcDNA3.1(-)组和空白对照组（P＜0.01）。
　　6、血清饥饿诱导凋亡后，Annexin V-APC/PI双染流式检测发现：pcDNA3.1(-)-C组凋亡率为13.13±0.26，低于pcDNA3.1(-)组（19.90±1.14）和空白对照组（19.09±0.59），差异有统计学意义，而pcDNA3.1(-)组和空白对照组细胞凋亡率无明显差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1.1b基因型HCV核心蛋白转染Huh7细胞能够促进细胞增殖。
　　2.1b基因型HCV核心蛋白能够上调Huh7细胞中β-catenin的表达、增强TCF转录因子活性，激活了wnt/β-catenin/TCF信号通路。
　　3.1b基因型HCV核心蛋白可以抑制血清饥饿诱导后Huh7细胞的凋亡。

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前言

实验材料

1.菌株和质粒

2.细胞

3.主要实验试剂

4.主要溶液配制

5.实验所需引物

6.主要实验设备

实验方法

1.细菌的复苏、接种及培养

2.Huh7肝癌细胞系培养

3.转染

4.MTT法检测细胞增殖

5.RT-PCR检测HCV core mRNA的表达以及β-catenin mRNA的相对表达量

6.Western Blot检测Huh7细胞中HCV 核心蛋白的表达、β-catenin和无血清诱导后Caspase-3的相对表达量

7.双荧光素酶报告基因检测TCF转录因子活性

8.流式细胞术检测血清饥饿诱导的各组Huh7细胞凋亡

9.统计学处理

实验结果

1.HCV core、β-catenin mRNA的表达

2.MTT法检测各组细胞增殖

3.HCV核心蛋白能够上调Huh7细胞β-catenin的表达

4.HCV核心蛋白增强了Huh7细胞TCF转录因子活性

5.HCV核心蛋白抑制了血清饥饿诱导的Huh7细胞的凋亡

讨论

结论

参考文献

综述

硕士期间发表的论文

致谢