硫化氢通过改善自噬流拮抗槟榔碱诱导的PC12细胞毒性

摘要

背景与目的：槟榔碱(Arecoline)是槟榔中最主要的生物碱，能诱导神经细胞毒性。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)是近年来已被证明的一种内源性气体性神经保护因子，本课题小组已经发现H2S对槟榔碱诱导的神经细胞毒性具有保护作用。然而，H2S的抗槟榔碱所致的神经细胞毒性的具体作用机制仍不清楚。大量研究发现自噬流参与了神经保护作用。因此，本实验拟探讨自噬流是否参与H2S对槟榔碱诱导的神经毒性的拮抗作用，以深入阐释H2S抗槟榔碱神经毒性的作用机制。
　　方法：乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测PC12细胞LDH的释放率；Annexin V/propidium iodide(PI)染色流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率；Hoechst33258染色法检测凋亡细胞的形态；JC-1染色法检测PC12细胞的线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potentia,MMP)。透射电镜观察PC12细胞的自噬结构。Western blot检测PC12细胞的LC3I和LC3II蛋白(微管结合蛋白1A和1B的第三条轻链-I&II, Microtubule-associated protein1A/1B-light chain3-I&II)和p62蛋白以及内质网应激的分子标记蛋白即葡萄糖调节蛋白(Glucose-regulated protein78,GRP78)和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase, Cleaved caspase-12)的表达。
　　结果：槟榔碱(0.5、1和2mM)处理PC12细胞24h能明显增加细胞自噬泡的数量、增大LC3II/LC3I的比值以及增加p62蛋白的表达水平，表明槟榔碱可对PC12细胞的自噬流产生阻断作用。10μM的自噬流的抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)预处理30min并没有加重槟榔碱(1mM,24h)对PC12细胞自噬流的阻断作用。200μM和400μM的NaHS(H2S供体)处理PC12细胞24h后，PC12细胞的自噬泡数量减少、LC3II/LC3I的比值和p62蛋白的表达水平显著降低，表明H2S可促进PC12细胞自噬流。预处理NaHS(200μM和400μM)可逆转槟榔碱诱导的自噬泡数量的增加、LC3II/LC3I的比值的增大以及p62蛋白表达的上调，表明H2S可改善槟榔碱对PC12细胞自噬流的阻断作用。10μM的CQ预处理30min可明显减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞自噬泡数量的增加、LC3II/LC3I的比值的增大以及p62蛋白表达的上调的逆转作用，表明抑制自噬流可拮抗H2S对槟榔碱诱导的PC12细胞自噬流阻断的改善作用。CQ(10μM,30min)预处理可以减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞LDH释放量增加的抑制作用，表明抑制自噬流可取消H2S对槟榔碱所致的PC12细胞毒性的保护作用；CQ(10μM,30min)预处理还可以减轻NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞凋亡率的增加、凋亡形态的发生和MMP的降低的逆转作用，表明抑制自噬流可减弱H2S的抗槟榔碱诱导的PC12细胞凋亡；CQ(10μM)预处理30min也可显著取消NaHS对槟榔碱诱导的PC12细胞GRP78和Cleaved caspase-12蛋白上调的抑制作用，表明抑制自噬流可减轻H2S对槟榔碱诱导的PC12细胞内质网应激的拮抗作用。
　　结论：H2S可改善槟榔碱对PC12细胞自噬流的阻断作用，这种改善作用参与了其对槟榔碱神经毒性的拮抗作用。

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缩略词

第1章 绪论

1.1 槟榔碱的神经毒性

1.2 硫化氢 (Hydrogen sulfide, H2S) 的神经保护作用

1.3 自噬流的神经保护作用

1.4 本课题的科学假说和研究思路

第2章 材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 药品与试剂的配制

2.3 实验方法

第3章 结果

3.1 槟榔碱可抑制PC12细胞的自噬流

3.2 H2S可逆转槟榔碱对PC12细胞自噬流的抑制作用

3.3 阻断自噬流可逆转H2S对槟榔碱神经细胞毒性的拮抗作用

第4章 讨论

4.1 槟榔碱可诱导 PC12细胞内质网应激和凋亡

4.2 H2S可抑制槟榔碱诱导的PC12细胞内质网应激和凋亡

4.3 槟榔碱可抑制PC12细胞的自噬流

4.4 H2S能改善槟榔碱对PC12细胞自噬流的抑制作用

4.5 自噬流介导H2S对槟榔碱诱导的PC12细胞内质网应激和凋亡的保护作用

第5章 结论

参考文献

文献综述

攻读硕士期间的发表的论文

致谢