重新设计血红素活性中心调控肌红蛋白的多重催化功能

摘要

血红素蛋白执行着许多生理功能，包含有电子传递，运载氧，生物催化及生物传感。更有趣的是，同种血红素蛋白在不同的环境下可表现出不同的生理功能。为了揭示血红素蛋白的结构-功能之间的关系以及为人们创造具有更多功能的人工血红素蛋白，我们以肌红蛋白（Mb）为血红素蛋白质模型，重新设计了血红素活性中心，通过引入一个或两个远端组氨酸，突变了天然的远端His64（组氨酸到丙氨酸的突变），创建了一个血红素中心的通道。通过测量它们的亚硝酸盐还原酶（NIR）活性以及在过氧化氢的存在下使用邻甲氧基苯酚和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐作为典型的底物的过氧化物酶活性，我们发现一个到血红素铁位置合适的远端组氨酸以及到血红素活性中心的水分子通道的构建（F43H/H64A Mb）在还原亚硝酸盐时起着至关重要的作用。另外，有两个远端组氨酸和通往血红素空腔的一条水分子通道的突变体,L29H/F43H/H64A Mb,表现出了增强的过氧化物酶活性。
　　另外，我们还合理地在肌红蛋白（Mb）的骨架上引入了一对半胱氨酸（F46C/M55C），模拟天然的神经红蛋白。分子建模表明，Cys46和Cys55有可能形成分子内二硫建，我们已经用电喷雾质谱（ESI-MS）分析，DTNB反应和圆二色谱（CD）等实验方法证实了二硫键的存在。此外，结果表明，Cys46-Cys55二硫键的形成不仅调控了血红素活性位点的结构，也调节了蛋白质的功能。重要的是，在F46C/M55C Mb内Cys46-Cys55二硫键的形成提高了蛋白质的稳定性，引起过氧化物酶活性的增加。这些结果为阐明血红素蛋白结构-功能之间的关系提供了有用信息。另外，这些方法也有望延伸到其他人工酶的催化活性的提高。

目录

声明

主要英文缩略语索引

第1章 绪 论

1.1 血红素蛋白的功能多样性

1.2血红素蛋白分子的理性设计

1.3 肌红蛋白简介

1.4 本论文的研究目的、内容及意义

第2章 重新设计血红素活性中心调控肌红蛋白的亚硝酸盐还原酶活性

引言

2.1 肌红蛋白及其突变体蛋白的表达与纯化

2.2 亚硝酸盐还原酶活性研究实验

2.3 电子顺磁波谱研究

2.4 盐酸胍诱导去折叠实验

2.5 X-射线晶体的研究

2.6突变体蛋白与其他血红素蛋白质的结构和NIR活性的比较

2.7 小结

第3章 重新设计血红素活性中心调控肌红蛋白的过氧化物酶活性

引言

3.1 肌红蛋白的制备

3.2 过氧化物酶活性研究实验

3.3 小结

第4章 分子内二硫键的构建及其对肌红蛋白结构与过氧化物酶催化功能的影响

引言

4.1 肌红蛋白及其突变体蛋白的表达与纯化

4.2 F46C/M55C Mb结构模拟

4.3 二硫键的检测

4.4 紫外可见光谱分析

4.5 电子顺磁波谱分析

4.6 盐酸胍诱导去折叠实验

4.7 活性过氧化氢实验

4.8过氧化物酶活性实验

4.9 小结

第5章 结 论

参考文献

攻读硕士学位期间的科研成果

致谢