肿瘤发生候选基因ASB11-1和心脏发育候选基因XIRP1的表达和功能初步研究

摘要

肿瘤严重危害着人类的身体健康,因此研究肿瘤相关基因及其分子机制对于肿瘤的治疗至关重要。在肿瘤的研究中已发现,某些基因在时空上的表达紊乱可导致肿瘤的发生。鉴定与肿瘤发生相关的基因和分子途径,将促使人们从分子水平认识肿瘤发生的机制。本文克隆的ASB11-1基因属于ASB基因家族的新成员,其编码蛋白含有两个结构域,6个被称为ankyrin repeat的锚蛋白重复序列位于其N端,在其C端是一个被称为SOCS的细胞信号因子抑制结构域。该基因位于染色体Xp22.31上,由7个外显子构成。RT-PCR检测癌细胞系与正常组织该基因的表达差异,发现该基因表达明显上调,暗示该基因可能与癌症相关。Northern blot显示ASB11包含2.9kb和5.0kb两个转录本,并且两个转录本在心肌和骨骼肌特异性表达。亚细胞定位显示ASB11-1基因在细胞质和细胞核表达。通过对p53、p21信号途径分析以及mRNA、蛋白表达水平的检测,发现该基因明显上调p53、p21的表达水平。已有的文献报道XIRP1基因是人类心脏和骨骼肌特异表达的基因,其鸡的同源基因参与BMP-Nkx2.5-MEF2C途径而调节心肌的形成,其同源基因在Nkx2.5、MEF2C敲除小鼠中表达量明显下调,说明XIRP1基因是Nkx2.5、MEF2C的靶基因,为了进一步的弄清其调节机制,本人克隆了XIRP1基因上游2100bp的区域,通过将2.1kb的区域分段成1.9kb、1.2kb、1.0kb、0.8kb、0.6kb、0.3kb、0.2kb分别克隆到pGL3-basic载体,进行荧光素酶活性检测确定了在转录起始位点上游-127——77的50bp区域活性最强为启动子核心区域,将核心区域上的Nkx2.5、MEF2C、Hand2位点突变后,发现其活性明显下降,从而证实了Nkx2.5、MEF2C、Hand2位点的真实性,并说明Nxk2.5、MEF2C、Hand2可能是通过调节启动子区域来调节XIRP1基因的表达,并且首次发现XIRP1基因也是Hand2的靶基因。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1.1 癌症发生的相关基因

1.1.1 原癌基因

1.1.2 抑癌基因

1.1.3 转录因子

1.1.4 其它生长因子和受体

1.2 细胞周期调控与肿瘤关系简述

1.2.1 CDK1.复合体对细胞周期调控机制

1.2.2 Cyclins复合体对细胞周期调控机制

1.2.3 CKI对细胞周期调控机制

1.2.4 p53对细胞周期的调节

1.3 泛素蛋白酶体途径与癌症关系

1.3.1 泛素-蛋白酶体系统组成及功能

1.3.2 泛素-蛋白酶体途径与p53

1.3.3 泛素-蛋白酶体途径与p27、cyclin

1.3.4 泛素-蛋白酶体途径与HIF、NF-KB

1.3.5 泛素-蛋白酶体途径与恶性肿瘤的其他相关研究

1.4 ASB基因家族与泛素-蛋白酶体途径

1.5 本课题研究的意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 生物信息学软件

2.1.2 主要试剂

2.1.3 细胞、菌株和质粒

2.1.4 主要实验仪器和耗材

2.2 方法

2.2.1 总RNA的抽提

2.2.2 PCR反应

2.2.3 Northern blot

2.2.4 细胞培养

2.2.5 细胞瞬时转染和稳定转染的筛选

2.2.6 荧光素酶分析

2.2.7 Western blot

2.2.8 本文所用质粒构建流程图

第三章 实验结果及其分析

3.1 人类ASB11基因计算机克隆及生物信息学分析

3.1.1 ASB11基因计算机克隆

3.1.2 ASB11蛋白质产物

3.1.3 ASB11与同源基因的编码蛋白的同源性比较及进化分析

3.1.4 人ASB基因家族保守性比较

3.2 ASB11-1基因ORF克隆

3.3 ASB11-1亚细胞定位分析

3.4 ASB11 Nortem blot分析

3.5 ASB11-1在成人组织与细胞系中的表达差异

3.6 ASB11-1对p53、p21的影响

3.6.1 ASB11-1信号途径分析

3.6.2 ASB11-1对p53、p21mRNA水平的影响

3.6.3 ASB11-1对p53、p21蛋白水平的影响

3.6.4 ASB11-1对MDM2的影响

第四章 讨论

4.1 ASB11-1与泛素-蛋白酶体降解途径的关系

4.2 ASB11-1与肿瘤的关系

结语

参考文献

第五章 其他工作

5.1 前言

5.1.1 心脏发育简介

5.1.2 启动子简介

5.2 材料和方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.3 结果及其分析

5.3.1 启动子的克隆和生物信息学分析

5.3.2 启动子活性研究

5.4 小结

参考文献

附录1

附录2

致谢