虎纹捕鸟蛛毒素-XV的分离纯化和部分性质研究及ZIC肽的二硫键定位

摘要

虎纹捕鸟蛛毒素-ⅩⅤ(HWTX-ⅩⅤ)是从虎纹捕鸟蛛初毒中分离纯化出来的一种含量很少的毒素,MALDI-TOF质谱鉴定和Edman降解测序结果表明:HWTX—ⅩⅤ的分子量为3508.5 Da,含有31个氨基酸残基,其中6个半胱氨酸残基形成了三对二硫键(Ⅰ-Ⅳ,Ⅱ—Ⅴ和Ⅲ-Ⅵ)。虽然通过上网搜寻发现虎纹捕鸟蛛毒素-ⅩⅤ与我们实验室以前研究过的虎纹捕鸟蛛凝集素-Ⅰ(SHL-Ⅰ)有很高的序列同源性(74％),但与虎纹捕鸟蛛凝集素-Ⅰ不同的是虎纹捕鸟蛛毒素-ⅩⅤ没有细胞凝集活性,而毒性试验却表明虎纹捕鸟蛛毒素-ⅩⅤ具有虎纹捕鸟蛛凝集素-Ⅰ所没有的神经毒性。本文通过比较两者的空间结构,表明两个多肽的结构差异是导致上述不同的生物学活性的重要因素。
　　 ZIC肽是深圳翰宇公司合成的一种芋螺毒素,ZIC肽分子量为2639.6 Da,含有25个氨基酸残基,含6个半胱氨酸残基,其位置在第1,8,15,16,20和25位,其N端和C端都是半胱氨酸。本文采用TCEP部分还原结合Edman降解测序测定了ZIC肽的二硫键连接方式。通过对比实测分子量和理论计算分子量,可确定该多肽6个半胱氨酸残基形成了3对二硫键；ZIC肽在酸性条件下与TCEP反应分别形成1、2和3对二硫键被还原的多肽；将部分还原的多肽(1和2对二硫键被还原)与碘乙酰胺(IAA)反应,使还原的游离巯基烷基化:烷基化的半胱氨酸残基位置通过Edman降解测序予以分析。最终确定ZIC肽的二硫键连接方式为Cys1-Cys16、Cys8-Cys20和Cys15-Cys25。

目录

文摘

英文文摘

第一章 综述

1.1 蜘蛛毒素的研究概况

1.2 蜘蛛多肽毒素的空间结构

1.3 多肽氨基酸序列分析技术

第二章 虎纹捕鸟蛛毒素-X V的分离纯化和部分性质研究

2.1 引言

2.2 材料,试剂与仪器

2.3 方法

2.3.1 HWTX-XV的分离纯化

2.3.2 MALDI-TOF质谱分析

2.3.3 氨基酸序列测定

2.3.4 生物活性测定

2.3.5 同源序列搜索和三维结构模拟

2.3.6 cDNA全长序列

2.4 结果与讨

2.4.1 HWTX-XV的分离纯化

2.4.2 氨基酸序列测定和同源序列比对

2.4.3 HWTX-XV的cDNA全长序列

2.4.4 HWTX-XV的生物学活性

2.4.5 HWTX-XV与SHL-I的三维结构比较

第三章 ZIC肽的二硫键定位

3.1 引言

3.2 材料,试剂与仪器

3.3 方法

3.3.1 质谱测定ZIC肽的分子量

3.3.2 ZIC肽部分还原

3.3.3 烷基化修饰及序列分析

3.4 结果与讨论

3.4.1 部分还原及二硫键对数的确定

3.4.2 烷基化修饰

3.4.3 确定出第一对二硫键

3.4.4 确定出第二对二硫键

3.4.5 确定出第三对二硫键

3.4.6 讨论

第四章 主要研究结论和下一步研究设想

4.1 主要研究结论

4.2 下一步研究设想

参考文献

附录1 缩写表

附录2 论文发表情况

致谢