SPITC试剂结合18O标记进行蛋白质同步定性和定量方法学研究

摘要

本文采用磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)试剂结合18O标记方法,建立了一种新的能够同步完成定量和从头测序的蛋白质组学研究方法。
　　 本研究首先在标准肽(Fibrinopeptide,MW1570Da)中探讨了标记步骤的不同对于标记稳定性的影响,即先进行SPITC衍生后使用18O标记和先进行18O标记后使用SPITC衍生。研究结果表明标记顺序的不同,对于标记稳定性没有明显影响。标记后肽段的一级图谱采用基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)的负离子(Negative ion)模式进行检测,标记后肽段的二级图谱采用MALDI-TOF/TOF的LIFT模式进行检测。通过比较未经标记的标准肽和双标后的标准肽二级图谱,结果显示标记后图谱的碎片峰更为单一,便于图谱解析。
　　 本文中使用的基质2,4,6-三羟基苯乙酮和柠檬酸氢二铵(THAP/DAC)比在MALDI中的常用基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)更能提高磺化后肽段的响应度,利于进行相关肽段对的定量评估。
　　 本研究分别在一种标准肽和一种标准蛋白中对该方法进行了定量线性相关性地评估。在标准蛋白中,选取以下三个目的肽段,其分子量(负离子模式下)分别为:925Da(完成双标后的肽段对分子量为1140Da/1144Da),1477Da(完成双标后的肽段对分子量为1692Da/1696Da),1565Da,(完成双标后的肽段对分子量为1780Da/1784Da)。定量结果表明,在标准肽中,从0.1到10的动态范围之间的定量线性相关性良好,R2值为0.998；在标准蛋白中,10倍动态范围内的定量线性相关性亦均表现为良好,R2值均大于0.9。
　　 基于在标准样品中取得良好的结果,本研究将该方法在基因组未知的蜘蛛毒素样品中进行了应用,不仅三种蜘蛛毒素的序列测定及定量结果准确,而且还获得了毒素样品中含有的未知蛋白/肽段的序列及定量信息。
　　 综上所述,本研究所采用的试剂均方便易得,价格低廉,无需做进一步处理即可使用,避免了常用途径中,以合成特定的同位素试剂来完成蛋白质同步定性和定量的麻烦。因此,本方法以其简便、廉价的优点而具有广泛的实际可行性。

目录

文摘

英文文摘

缩写表

第一章 前言

1.1 蛋白质组学研究及其发展现状

1.1.1 蛋白质组学的概念

1.1.2 蛋白质组学研究的主要内容

1.1.3 蛋白质组研究的主要技术手段

1.1.4 生物质谱技术在蛋白质鉴定中的应用

1.2 磺酸化修饰策略辅助生物质谱对蛋白质的鉴定

1.2.1 磺酸基对肽段解离的诱导作用原理

1.2.2 磺苯基异硫氰酸(4-Sulphophenyl isothiocyanate,SPITC)试剂修饰辅助蛋白质/肽段鉴定

1.2.3 MALDI基质的选择

1.3 定量蛋白质组学(QUANTITATIVE PROTEOMICS)

1.3.1 常用的定量标记方法及不同方法之间的比较

1.3.2 18O标记方法在定量蛋白质组学研究中的应用

1.4 蜘蛛毒素及其相关研究背景

1.5 本试验的研究背景及思路

第二章 SPITC试剂结合18O标记方法在标准肽中的条件优化

2.1 材料与试剂仪器

2.2 实验方法

2.2.1 标准肽的18O标记和SPITC衍生

2.2.2 饱和CCA基质的配制

2.2.3 THAP/DAC基质的配制

2.2.4 MALD-TOF/TOF质谱鉴定

2.3 结果与讨论

2.3.1 标准肽双标步骤先后顺序MS对比图谱

2.3.2 标准肽双标后的MS/MS图谱

2.3.3 饱和CCA基质与THAP/DAC基质的对比

第三章 SPITC试剂结合18O标记方法在标准肽中的定量线性相关性评估

3.1 材料与试剂

3.2 实验方法

3.2.1 标准肽的18O标记和SPITC衍生

3.2.2 THAP/DAC基质的配制

3.2.3 MALD-TOF/TOF质谱鉴定

3.3 结果与讨论

3.3.1 标准肽完成双标后的定量线性评估

3.3.2 标准肽完成双标后的定量图谱

第四章 SPITC试剂结合18O标记方法在标准蛋白中的验证

4.1 材料与试剂

4.2 实验方法

4.2.1 牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)的溶液酶解

4.2.2 牛血清蛋白(BSA)酶解肽段的双标反应

4.2.3 THAP/DAC基质的配制

4.2.4 MALD-TOF/TOF质谱鉴定

4.3 结果及讨论

4.3.1 BSA酶解肽段完成双标后的一级定量图谱及定量线性相关性评估

4.32 BSA酶解肽段完成双标后的二级测序图谱

第五章 SPITC试剂结合18O标记方法在蜘蛛毒素样品中的应用

5.1 引言

5.2 材料与试剂

5.3 实验方法

5.3.1 蜘蛛毒素的溶液酶解

5.3.2 酶解肽段的双标反应

5.3.3 THAP/DAC基质的配制

5.3.4 完成双标后蛛毒素样品进行MALD-TOF/TOF质谱鉴定

5.3.5 Blast搜索

5.4 结果及讨论

5.4.1 完成双标后的三种蜘蛛毒素的一级定量图谱

5.4.2 完成双标后的各蜘蛛毒素成分的二级测序图谱

总结、

参考文献

论文发表情况

参加学术会议情况

致谢