肠毒素大肠杆菌K88生物探针制备及其快速检测分析技术研究

摘要

肠毒素大肠杆菌K88(ETECK88)是一种常见的肠道微生物，也是引起仔猪腹泻和死亡的主要致病微生物。养殖业中准确、低成本、简便、快速地找出引起仔猪腹泻的原因及微生物的种类甚至是血清型一直是一个难以攻克的难题，一些很好的生物产品如疫苗、卵黄抗体等也因此在仔猪疾病预防和治疗中的不能大规模低成本应用。建立和完善针对于ETECK88的低成本、简便、快速分析检测体系并实现在养殖业中的商业化应用是降低这一类致病微生物引起的仔猪死亡的重要手段。
　　本文以ETECK88为目标模式菌，利用生物学方法筛选和制备以K88菌毛蛋白为靶标的单克隆抗体和适配体、以ETECK88菌体为靶标的细胞适配体和适配体文库，鉴定了它们与靶标的结合性能，初步构建了基于这几种生物探针的检测体系分别用于K88菌毛蛋白和ETECK88菌体的快速检测分析。同时，成功建立了一个新的FluMag-Cell-SELEX(FluMagCellsystematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)细胞适配体筛选方法。实验结果如下:
　　本文优化了ETECK88的发酵工艺，在优化的玉米浆培养基和发酵条件的基础上制备纯度和浓度满足单克隆抗体和适配体筛选要求的K88菌毛蛋白，SDS-PAGE显示了单一条带，Bradford法测定浓度为0.642mg/ml。
　　利用杂交瘤技术制备并生物素化K88菌毛蛋白的单克隆抗体(K88mAb)，测定抗体效价为1∶12800，亲和力常数Kaff测定为（1.616±0.033）×108M-1，流式细胞仪分析和荧光显微镜分析抗体与目标菌结合性能良好，荧光分光光度计分析该抗体和ETECK88菌体有很好的结合特异性。初步建立了基于K88mAb的ABS-ELISA方法检测K88菌毛蛋白体系，确定其检测下限为12.53ng/ml。
　　采用多孔板法SELEX技术筛选到K88菌毛蛋白的DNA适配体，其中亲和力最高的适配体Apt37Kd值达到了25±4nmol。荧光显微镜和荧光分光光度计分析该适配体与目标菌结合性能良好而且有很好的结合特异性。初步建立了基于K88菌毛蛋白适配体Apt37的Aptamer-ABS-ELISA体系检测K88菌毛蛋白，确定其检测下限为25.1ng/ml。
　　分别采用SDS-PAGE和平板计数法验证了K88IMB(Immunomagneticbead)捕获ETECK88的可靠性，实验证明K88IMB对ETECK88在102、103CFU/ml的低浓度下捕获率分别可达74.5％和63.8％，说明K88IMB可有效应用在接下来的实验体系中。
　　经典离心分离法Cell-SELEX技术与本文建立的FluMag-Cell-SELEX技术筛选ETECK88细胞适配体得到了相同的高重复度序列，说明FluMag-Cell-SELEX技术是成功的。亲和力最高的细胞适配体测定Kd值为15±4nM。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析表明适配体AptB12、FluMag-Cell-SELEX技术中最后一轮的富集适配体文库这两种生物探针和ETECK88的结合性能均良好。
　　建立了基于细胞适配体/适配体文库的直接荧光探针分析-IMS(Immunomagneticseparation)技术相结合快速检测ETECK88体系。以细胞适配体文库作为直接荧光探针时，检测信号比单个适配体探针更强，体系对纯培养ETECK88的检测下限为1.1×103CFU/ml，对低至2.1×103CFU/g模拟的腹泻仔猪粪便样本都可以检测到可信信号。

目录

摘要

第一章 引言与文献综述

1．1 肠毒素大肠杆菌ETEC K88

1．1．1 大肠杆菌

1．1．2 肠毒素大肠杆菌(ETEC)

1．1．3 ETEC菌毛

1．1．4 ETEC K88和K88菌毛

1．2 大肠杆菌引起的仔猪腹泻

1．2．1 仔猪黄痢

1．2．2 仔猪白痢

1．2．3 断奶仔猪腹泻

1．3 大肠杆菌的检测方法

1．3．1 标准检测方法和血清型鉴定

1．3．2 新型快速检测方法

1．4 用于大肠杆菌检测的生物探针

1．4．1 核酸(DNA)探针

1．4．2 抗体探针

1．4．3 适配体探针

1．5 适配体

1．5．1 适配体与靶目标的结合

1．5．2 适配体的筛选(SELEX技术)

1．5．3 适配体作为探针与抗体的比较优势

1．6 本课题研究的工作思路和主要内容

第二章 K88菌毛蛋白的提取纯化和单克隆抗体的制备

2．1 实验仪器与材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 菌种和培养基

2．1．3 实验动物及细胞

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 其他试剂

2．2 实验方法

2．2．1 ETEC K88菌毛蛋白的制备

2．2．2 ETEC K88菌毛蛋白的单克隆抗体制备

2．2．3 K88菌毛蛋白单克隆抗体生物素标记及Western Blot鉴定

2．2．4 K88菌毛蛋白单克隆抗体亲和力测定

2．2．5 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定

2．2．6 免疫荧光法测定单克隆抗体与ETEC K88菌的结合分析

2．2．7 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析

2．2．8 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS—ELISA体系对K88菌毛蛋白的检测灵敏度分析

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 ETEC K88菌毛蛋白的制备

2．3．2 ETEC K88菌毛蛋白单克隆抗体的筛选和制备

2．3．3 K88菌毛蛋白单克隆抗体效价测定

2．3．4 K88菌毛蛋白单克隆抗体的亲和力测定

2．3．5 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结台性能分析

2．3．6 K88菌毛蛋白单克隆抗体与ETEC K88的结合特异性分析

2．3．7 基于K88菌毛蛋白单克隆抗体的ABS-ELlSA体系检测ETEC K88菌毛蛋白的灵敏度分析

2．4 讨论和小结

第三章 ETEC K88菌毛蛋白适配体的筛选、鉴定及利用Aptamer-ABS-ELISA方法快速分析ETEC K88菌毛蛋白

3．1 实验仪器与材料

3．1．1 主要仪器

3．1．2 菌种和培养基

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 其他试剂

3．1．5 随机ssDNA文库的构建以及引物合成

3．1．6 适配体的合成和修饰

3．2 实验方法

3．2．1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)

3．2．2 ETEC K88菌毛蛋白的制备

3．2．3 SELEX过程

3．2．4 胶回收纯化ssDNA文库

3．2．5 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析

3．2．6 测序

3．2．7 克隆序列分析及二级结构预测

3．2．8 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定

3．2．9 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88结合性能分析

3．2．10 K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合特异性分析

3．2．11 基于适配体的Aptamer-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系检测ETEC K88的灵敏度分析

3．3 实验结果

3．3．1 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析

3．3．2 克隆序列一级结构序列同源性分析

3．3．3 候选适配体二级结构预测

3．3．4 候选K88菌毛蛋白适配体与ETEC K88的结合性能分析

3．3．5 K88菌毛蛋白适配体亲和力测定

3．3．6 K88菌毛蛋白适配体和ETEC K88的结合性能分析

3．3．7 K88菌毛蛋白适配体的与ETEC K88的结合特异性分析

3．3．8 基于K88菌毛蛋白适配体的Aptamer-ABS-ELISA法检测ETEC K88菌毛蛋白体系的灵敏度分析

3．4 讨论和小结

第四章 不同Cell-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体

4．1 实验仪器与材料

4．1．1 主要仪器

4．1．2 菌种和培养基

4．1．3 主要试剂配制

4．1．4 其他试剂

4．1．5 随机ssDNA文库的构建以及引物合成

4．1．6 适配体的合成和修饰

4．2 实验方法

4．2．1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)

4．2．2 经典Cell-SELEX过程(离心分离法)

4．2．3 荧光磁珠法Cell-SELEX(FluMag-Cell-SELEX)过程

4．2．4 ssDNA文库的胶回收和纯化

4．2．5 反筛(counter-SELEX)

4．2．6 富集文库与K88菌毛蛋白的结合率分析

4．2．7 测序

4．2．8 克隆序列分析及二级结构预测

4．2．9 K88免疫磁珠(K88 IMB)的可靠性研究

4．3 实验结果

4．3．1 K88 IMB的可靠性研究

4．3．2 经典SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体

4．3．3 FluMag-Cell-SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体

4．3．4 两种SELEX技术筛选ETEC K88细胞适配体对比

4．4 讨论和小结

第五章 基于细胞适配体／细胞适配体文库直接荧光探针分析与免疫磁分离技术相结合快速检测ETEC K88研究

5．1 实验仪器与材料

5．1．1 主要仪器

5．1．2 菌种和培养基

5．1．3 主要试剂配制

5．1．4 其他试剂

5．1．5 适配体的合成和修饰

5．2 实验方法

5．2．1 细菌的准备和稀释平板菌落计数(MPN)

5．2．2 FITC修饰的适配体文库的扩增

5．2．3 ETEC K88细胞适配体亲和力测定

5．2．4 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库(aptamer library)与ETEC K88的结合性能分析

5．2．5 基于细胞适配体／适配体文库的直接荧光分析法-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88

5．3 实验结果

5．3．1 ETEC K88细胞适配体亲和力测定

5．3．2 ETEC K88细胞适配体和细胞适配体文库(aptamer library)与ETEC K88的结合性能分析

5．3．3 基于细胞适配体，适配体文库的直接荧光探针分析-IMS技术相结合快速分析检测ETEC K88

5．4 讨论和小结

第六章 结论和展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

攻读博士学位期间撰写、发表的学术论文

致谢

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