甘露糖阳离子脂质体基因载体的合成与性能研究

摘要

阳离子脂质体具有细胞毒性低、无免疫原性以及制备方便、使用简单、易于保存等诸多优点，而倍受学者关注，是目前最有前景的非病毒性基因载体。
　　本论文合成了两类阳离子脂质体。一类以甘露糖为原料，通过全乙酰化、脱1-O-乙酰基、三氯乙酰亚胺酯化、糖苷化、叠氮化、脱全部乙酰基、4，6-O-苄叉基保护、醚化、脱苄叉基保护、还原氨化和季铵盐化反应，合成不同长度的疏水链连接在糖环上的甘露糖阳离子脂质一系列:di-C12-Man-TMA、di-C14-Man-TMA、di-C16-Man-TMA和di-C18-Man-TMA;另一类以甘露糖为原料，通过全乙酰化、脱1-O-乙酰基、三氯乙酰亚胺酯化、糖苷化、叠氮化、脱全部乙酰基、还原氨化、叔胺化、和季铵盐化反应，合成另一系列不同长度的疏水链连接在头基的甘露糖阳离子脂质:Man-DiC12MA、Man-DiC14MA、Man-DiC16MA和Man-DiC18MA。
　　将脂质溶于二次蒸馏水中，超声至澄清，制备成阳离子脂质体，再跟装载EGFP的质粒DNA混合制备得到脂质体/DNA复合物。采用原子力显微镜观察阳离子脂质体和阳离子脂质体复合物的形态。用Zetasizer Nano ZS激光粒度仪测定阳离子脂质体及其DNA复合物的Zeta电势、平均粒径和粒径分布。实验结果显示:脂质体di-C18-Man-TMA和Man-DiC18MA的平均粒径分别为624.1nm和502.2nm，因为平均粒径偏大而不适于基因转染实验。其它6种单一脂质体的平均粒径在40-200nm之间，与之对应的DNA复合物的平均粒径在60-200nm之间。di-C18-Man-TMA的Zeta电位为26mV，其它7种脂质体的Zeta电位都大于35mV。通过凝胶电泳实验，探测阳离子脂质体跟质粒DNA的结合能力以及完全复合时的N/P比。实验结果表明，在N/P比为3∶1时，各阳离子脂质体和质粒DNA结合完全，而且，随着脂质体的增加，DNA延滞作用越明显。以上实验结果表明，各阳离子脂质体适于转染质粒DNA。
　　选择商用转染试剂Lipo2000作为对照组，观察携带pEGFP的两类脂质体在HEK293细胞系内的表达情况，并评估离子脂质体的转染效率。实验结果表明，疏水链与糖环链接的阳离子脂质体基本没有转染效率，而疏水链与季铵盐头部相连的阳离子脂质体系具有较高的转染效果，其中Man-DiC16MA具有较好的转染效果。
　　商用转染试剂Lipo2000作为对照组，Man-DiC14MA和Man-DiC16MA两种脂质体分别在HepG2细胞和Hela细胞系中观察其转染情况。结果显示，Man-DiC16MA在两种细胞中转染效率较好，但低于Lipo2000。Man-DiC14MA基本没有转染。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 基因治疗和基因载体简介

1．2 阳离子脂质体简介

1．3 助脂质体的简介

1．4 论文的研究思路和主要内容

第二章 甘露糖阳离子脂质体的设计与合成

2．1 阳离子脂质分子的设计

2．2 甘露糖阳离子脂质体的合成

2．3 试剂与仪器

2．3．1 实验试剂

2．3．2 实验仪器

2．4 实验内容

第三章 阳离子脂质体纳米粒子、脂质体／DNA复合物的制备及其性能测试

3．1 试剂与仪器

3．2 实验内容

3．2．1 阳离子脂质体纳米粒子的制备

3．2．2 阳离子脂质体／DNA复合物的制备

3．2．3 阳离子脂质体纳米粒子粒径和表面电势的测定

3．2．4 脂质体／DNA复合物的粒径和表面电势的测定

3．2．5 阳离子脂质体及其复合物纳米颗粒的表面表征

3．3 结果与讨论

3．3．1 阳离子脂质体纳米颗粒的制备

3．3．2 脂质体／DNA复合物的制备

3．3．3 阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电势的测定

3．3．4 脂质体／DNA复合物的粒径和表面电势的测定

3．3．5 脂质体及脂质体／DNA复合物的表面形貌的测定

第四章 阳离子脂质体／DNA复合物的体外转染与毒性研究

4．1 主要仪器和试剂

4．2 实验内容

4．2．1 细胞培养

4．2．2 凝胶电泳阻滞实验

4．2．3 体外转染实验

4．2．4 细胞计数

4．2．5 细胞毒性实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 凝胶电泳阻滞实验

4．3．2 体外细胞转染实验

4．3．3 细胞计数

4．3．4 细胞毒性实验

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

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