补肾通络方及其灌胃大鼠血浆中活性成分测定方法研究

摘要

目的：⑴建立同时测定补肾通络方中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量的方法；⑵建立高灵敏度、稳定高效的HPLC方法，测定灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量；⑶建立AMS方法对补肾通络方中酚酸类成分丹酚酸B进行半定量分析，建立HPLC-UV方法对丹酚酸B进行准确定量。
　　方法：①采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.01％乙酸水溶液(35∶65，V/V)，检测波长为240 nm(马钱苷)、320 nm(阿魏酸和二苯乙烯苷)，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10μL。②以甲醇-乙酸乙酯(3∶1)提取处理血浆，氮气吹干后流动相复溶进样。色谱条件:Johnson spherigel C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇-0.01％乙酸水溶液，梯度洗脱;检测波长:马钱苷为240 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷为320 nm;流速:1 mL/min;柱温:30℃;进样量:10μL。③采用常压离子化质谱进行半定量，高效液相色谱准确定量。高压离子源，氦气流速0.6 L/min，电压3.5 kV，加热温度100℃，全扫描检测，负离子采集模式，进样量为10μL;色谱柱为Johnson spherigel(大连江申)C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.05％磷酸酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为285 nm，柱温为25℃，进样量:10μL。
　　结果：⑴马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷在所建立的色谱条件下峰形良好，质量浓度分别在5～250、0.5～25、6～300μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r分别为0.9999、0.9999、0.9998，精密度试验的RSD＜2％，稳定性、重复性试验的RSD均小于3％，平均加样回收率分别为93.1％(RSD=1.9％，n=6)、96.3％(RSD=1.9％，n=6)和101％(RSD=1.9％，n=6)。⑵空白血浆中内源性物质不干扰样品的测定。马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷在0.03～3.00、0.03～3.00和0.02～2.00μg/mL范围内均有良好的线性关系(r≥0.999)，检测限依次为0.020、0.015和0.010μg/mL，提取回收率分别大于79％、74％和58％，日间、日内精密度(RSD)均分别小于10％、7.3％和9.7％，马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷在血浆中室温24 h内和反复冻融3次条件下稳定存在。⑶通过优化实验，建立了AMS法快速检测补肾通络方中丹酚酸B，丹酚酸B在2～200μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9961)，重复进样5次的RSD小于23％，本方法对样品的检测结果与HPLC-UV准确定量方法的检测结果一致，可用于补肾通络方中丹酚酸B的快速定性及半定量检测。
　　结论：①本实验建立的HPLC方法简单、准确，灵敏度高，可用于补肾通络方中马钱苷、阿魏酸、二苯乙烯苷和丹酚酸B的质量控制。②建立的灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量测定方法操作简便，灵敏，准确，可为补肾通络方中有效成分药动学研究提供实验基础。③所建立的AMS方法可快速高效地检测补肾通络方中酚酸类成分丹酚酸B，能作为一种半定量方法对目标成分进行快速检测。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 补肾通络方简介及研究现状

1．2．1 补肾通络方简介

1．2．2 临床应用

1．2．3 研究现状

1．3 中药复方中活性成分分析方法

1．3．1 气相色谱法

1．3．2 毛细管电泳

1．3．3 分子生物色谱法

1．3．4 红外吸收光谱法

1．3．5 高效液相色谱法及质谱法

1．4 血浆活性成分分析方法

1．4．1 药代动力学简介

1．4．2 生物样品简介

1．4．3 血浆活性成分在药代动力学研究中的应用

1．4．4 高效液相色谱及质谱技术在血浆活性成分分析中的应用

1．5 选题目的及意义

第二章 补肾通络方中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量测定

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验仪器

2．2．2 药品和试剂

2．2．3 溶液配制

2．2．4 色谱条件

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测波长的选择

2．3．2 流动相的选择

2．3．3 系统适用性

2．3．4 线性关系考察

2．3．5 精密度试验

2．3．6 重复性试验

2．3．7 稳定性试验

2．3．8 加样回收率试验

2．3．9 样品含量测定

2．4 小结

第三章 灌胃补肾通络方大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量测定的方法学研究

3．1 引言

3．2 仪器、试剂材料与方法

3．2．1 仪器

3．2．2 试剂与材料

3．2．3 对照品溶液的制备

3．2．4 血浆样品制备及预处理

3．2．5 色谱条件

3．3 结果与讨论

3．3．1 色谱条件的优化

3．3．2 血浆样品预处理的优化

3．3．3 方法专属性考察

3．3．4 标准曲线制备

3．3．5 最低检测限及定量限

3．3．6 精密度试验

3．3．7 重复性试验

3．3．8 提取回收率试验

3．3．9 稳定性试验

3．3．9 血药浓度测定

3．4 小结

第四章 补肾通络方中丹酚酸B含量测定

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 质谱条件

4．2．3 色谱条件

4．2．4 标准溶液的配制

4．2．5 样品处理

4．3 结果与讨论

4．3．1 质谱条件的优化

4．3．2 色谱条件的优化

4．3．3 专属性考察

4．3．4 AMS半定量分析

4．3．5 HPLC-UV准确定量分析

4．4 小结

结语与展望

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢

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