核酸探针用于核酸复制与酶活性的实时监测及点突变分析

摘要

核酸的复制是生命现象中最本质的内容之一，获取有关核酸和聚合酶作用的实时过程信息将有助于DNA复制过程机理的研究，而且还将为药物的筛选提供新的技术手段。传统的研究DNA复制过程的分析方法往往采用放射性标记结合凝胶电泳的方法，无法获取它们的动力学过程信息，因此发展实时的研究DNA复制过程的分析方法很有意义。 许多疾病如癌症和遗传病的发生都与基因的突变有关，因此对特定序列DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分重要的意义。发展简便、快速、特异的检测方法用于基因突变研究是非常重要的。 本论文针对上述两个问题，利用分子信标荧光探针和荧光染料探针，发展了实时监测DNA连续复制、聚合酶活性以及基于聚合反应的单核苷酸多态性(SNP)基因分型方法。主要内容包括以下三个方面：1、分子信标体外实时监测DNA连续复制过程。利用分子信标实现了对DNA连续复制过程的实时监测，分子信标作为DNA连续复制反应的模板和检测分子，实时准确地获取了DNA连续复制过程的信息。与传统的研究方法相比，该方法避免了放射性同位素标记、变性凝胶电泳、放射性自显影等复杂的操作，为DNA连续复制过程研究提供了一种新的非同位素分析方法，并在此基础上建立了快速准确的检测KlenowFragment(exo-)聚合酶的分析方法。拓展了分子信标用于核酸和蛋白质相互作用研究的应用领域。 2、发展了一种简便快速的聚合酶活性实时检测新方法。基于双链DNA结合染料能特异嵌入双链DNA发出荧光的原理，发展了一种实时检测DNA聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化实时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响。该方法不需要对寡核苷酸或dNTP进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速价廉的聚合酶活性实时检测新方法，为研究抗肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。 3、建立了基于等位特异性延伸的SNP基因分型新方法以及用于β地中海贫血点突变的检测。基于单碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响，以及染料SYBRGreenI与双链DNA结合发荧光的性质来识别有无聚合反应，从而达到对SNP位点的分析。该方法实验设计简单，无需合成标记探针，不需要昂贵的实时荧光PCR仪，是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法。运用此方法准确、快速地实现了β地中海贫血遗传性相关的单核苷酸多态性位点的基因分型。这种简单迅速的分型方法将为高通量的SNP基因分型提供一种新的思路和方法。

目录

文摘

英文文摘

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第1章绪论

第2章基于分子信标体外实时监测DNA连续复制过程

第3章一种简便快速的聚合酶活性实时检测新方法

第4章基于等位基因特异性延伸的SNP基因分型新方法及其在β地中海贫血点突变检测中的应用

结 论

参考文献

附 录(攻读学位期间所发表的学术论文目录)

致谢