基于非培养生物技术的堆肥微生物群落研究及木质纤维素降解

摘要

针对堆肥化环境微生物的复杂性以及木质纤维素难降解的特性，本文以农业秸秆为主要原料，采用好氧堆肥，从物理化学、酶学以及基于非培养生物技术的微生物群落结构演替等方面较系统地研究了接种黄孢原毛平革菌对堆肥发酵进程和木质纤维素降解的影响；并综合运用多种非培养生物研究方法与数学统计方法系统地研究堆肥化过程中微生物群落演替规律；基于上述规律研究其降解机理与特性并从堆肥化各阶段选育高效优势的降解菌株，为堆肥工艺的优化和接种剂的开发提供依据。 在稻草固态发酵体系中同时接种土壤微生物和黄孢原毛平革菌，用磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析法研究发酵过程的微生物群落和生物量变化，同时监测木质纤维素降解率的变化。结果表明，复合微生物体系降解木质纤维素的效率明显高于单一菌种的效率。根据标志性脂肪酸的变化，在发酵第6d，革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌的含量都达到了最高值，其中，革兰氏阳性菌的含量较低；真菌和细菌的脂肪酸含量比值变化范围为0.2～0.5，说明真菌是降解木质纤维素的主要群落。主成分分析结果显示发酵后期以18C不饱和脂肪酸为主，与标志性脂肪酸分析结果一致，同时跟木质纤维素降解率的变化趋势对应，因此PLFA分析法可以较好地反映稻草固态发酵过程中的微生物群落结构和生物量的变化。P.chrysosporium对应单体PLFA与木质纤维素相关性分析显示革兰氏阳性菌和真菌在降解木质素上具有相同的效率，P.chrysosporium是降解木质素的主要真菌。 用RFLP方法和酶活检测方法研究了在农业废物堆肥一次发酵和二次发酵期间添加黄孢原毛平革菌对微生物多样性和木质纤维素降解酶系的影响。结果表明，在不同发酵期接种P.chrysosporium对堆肥进程的影响不同：(1)三种典型的限制性内切酶AluⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ在分析堆肥细菌微生物多样性的灵敏性上，HaeⅢ效果最好，AluⅠ次之，TaqⅠ则不是很适用于分析堆肥细菌微生物多样性。添加的P.chrysosporium对堆肥系统中某些微生物更具有一定的选择作用，使其成为优势物种以促进堆肥物质的降解，多样性有所降低，二次接种能够巩固一次接种效果；(2)接种P.chrysosporium能够促进堆肥体系中的木质纤维素降解，实验结果显示接种P.chrysosporium的堆体中木质素降解率要明显高于未接种的堆体。接种P.chrysosporium对木聚糖酶活和CMC酶活的分泌没有明显影响，对Lip和Mnp酶活产生有促进作用，但是对Lac的产生有一定抑制作用。 组合应用了三类非培养生物技术，即PLFA法、RFLP法、DGGE法，分析农业废物堆肥化中微生物群落和多样性的变化。结果表明三类方法显示的信息并不完全一致：(1)PLFA法检测的样点数据PCA分布比较离散，说明每个样点都具有其特征图谱，样点选取具有代表性。三类方法中以PLFA数据指示的微生物多样性最高，同时PLFA数据可以表征较完整的微生物群落结构变化并较为明确的表征微生物生物量的变化。(2)RFLP法检测的样点和条带信息PCA分布都比较集中，数据还显示在堆肥后期的细菌群落具有不稳定性，RFLP法指示的微生物多样性较低；(3)DGGE方法检测的数据显示堆肥过程中细菌群落结构至少经历了三个阶段的演替，即嗜温细菌群落，高温细菌群落和腐熟期细菌群落。 根据从农林废物堆肥中筛选得到的木质素降解优势土著微生物枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、黑曲霉、简青霉、栗褐链霉菌，依据PLFA-PLS定量分析所得堆肥化二次发酵期有效的木质素降解微生物群落组成比例混合接种至稻草基质发酵瓶中，并通过正交实验L9(34)优化混合比例，以期研究开发一种基于木质素降解的高效堆肥化接种剂。结果表明，混合菌剂具有较强的木质素降解能力，其对木质素降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果；当细菌：放线菌：真菌个数比为85：5：10，枯草芽孢杆菌：铜绿假单孢菌为55：25，黑曲霉：简青霉为2：1时，木质素、纤维素、半纤维素降解率最高，分别达到22.13％、48.97％、55.93％。比空白样高出19.16％、38.25％、46.30％。

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论文说明：图表目录

声明

第1章绪论

1.1农业有机废物堆肥化研究进展

1.1.1农业有机废物来源及影响

1.1.2农业废物堆肥化的原理与基本工序

1.1.3堆肥化处理存在的主要问题

1.2堆肥化中微生物群落结构的研究进展

1.2.1堆肥中的微生物过程

1.2.2基于非培养生物方法的堆肥微生物研究进展

1.3自然界木质纤维素生物降解研究进展

1.3.1木质纤维素的结构

1.3.2木质纤维素降解酶机理研究

1.3.3木质纤维素降解微生物学研究

1.4本课题研究意义及内容

1.4.1研究意义

1.4.2研究内容

第2章PLFA法研究稻草固态发酵中微生物群落结构变化

2.1材料与方法

2.1.1实验设备

2.1.2菌种来源

2.1.3固态发酵体系

2.1.4参数测定

2.2结果与讨论

2.2.1木质纤维素含量变化

2.2.2生物量的变化

2.2.3微生物群落结构的变化

2.3.4木质纤维素降解与黄孢PLFA谱图变化的关系

2.3本章小结

第3章RFLP法研究农业废物堆肥微生物多样性变化

3.1材料与方法

3.1.1实验设备

3.1.2堆肥原料

3.1.3堆制方法

3.1.4参数测定

3.1.5分析方法

3.2结果与分析

3.2.1堆肥过程中pH的变化

3.2.2堆肥过程中种子发芽指数(GI)的变化

3.2.3 RFLP分析

3.3本章小结

第4章 非培养生物技术在堆肥微生物群落的组合应用研究

4.1材料与方法

4.1.1样品来源

4.1.2实验方法

4.1.3分析方法

4.2结果与分析

4.2.1堆肥化运行的主要参数

4.2.2堆肥微生物PLFA信息分析

4.2.3堆肥微生物DNA信息分析

4.2.4堆肥微生物PLFA、RFLP和DGGE谱图组合分析

4.3本章小结

第5章 农业废物堆肥化中木质纤维素降解酶系研究

5.1材料与方法

5.1.1堆肥原料

5.1.2堆制方法

5.1.3分析方法

5.2结果与分析

5.2.1堆肥化主要运行参数

5.2.2木质纤维素降解率变化

5.2.3堆肥过程中酶活的变化

5.3本章小结

第6章基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发研究

6.1 PLFA-PLS方法定量分析结果简介

6.2材料与方法

6.1.1菌种来源

6.1.2固态发酵培养条件

6.1.3试验设计

6.1.4生化参数的测定方法

6.1.5木质纤维素含量的测定

6.3结果与分析

6.2.1正交试验各组中的木质纤维素降解率

6.2.2最优配比混合菌剂组降解天然木质纤维素及产酶分析

6.2.3最优配比混合菌剂降解木质素对比分析

6.4本章小结

结论

参考文献

附录

致 谢