丙型肝炎病毒核心蛋白核酸适体抗病毒作用机制

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)是引起严重慢性肝脏疾病的主要病原体，世界上约有1.8亿的感染者。由于HCV的抗体产生周期长、HCV RNA含量低等使得通过检测抗-HCV及实时荧光定量PCR检测HCV RNA的方法存在严重的局限性。此外，HCV基因型具有高度变异性和突变性，使得目前的治疗效果很不理想。加之，缺乏有效的丙肝疫苗，所以开发出一种新型检测和治疗HCV的方法在全世界范围内刻不容缓。HCV感染性病毒颗粒产生模式是核心蛋白在脂滴表面富积，参与病毒颗粒在脂滴表面或附近的组装，然后在内质网内获得包膜，进一步分泌出体外。
　　 核酸适体被称为“化学抗体”，与抗体相比，核酸适体因其分子小、易合成和易修改而具有显著性优势。研究发现，运用SELEX技术筛选出的针对HCV核心蛋白的核酸适体在开发药物方面具有广阔的前景。本文将HCV核心蛋白分段克隆到原核/真核表达载体，并对core分段蛋白进行了原核表达及纯化。我们的研究结果显示:core蛋白核酸适体不仅能够特异性识别原核表达的重组core蛋白，还能检测出HCV病人血清中的core蛋白。研究还发现core核酸适体不影响HCV RNA的复制及病毒的释放，但抑制感染性病毒颗粒的产生。在核酸适体处理的HCV感染系统中，核酸适体没有诱导干扰素及干扰素刺激因子(ISGs)的产生，细胞外ELONA实验证实了核酸适体能够与HCV core蛋白D1和D2相互作用，在细胞内转入真核重组质粒D1及D1-D2后发现病毒的感染效果有了明显的逆转，这些结果表明抗病毒作用的产生是因为核酸适体影响了core蛋白的D1与D2区的生理学功能所致。进一步实验数据显示，这些核酸适体破坏了core蛋白与脂滴表面的共定位，影响了core蛋白与NS5A蛋白的相互作用，扰乱了core蛋白与病毒基因组RNA的结合。
　　 综上所述，core核酸适体是通过影响core蛋白的生理学功能来影响HCV病毒的组装，进而达到抑制感染性病毒产生的目的。总之，我们为研究core蛋白在病毒生活周期中的作用提供了新的实验工具，为开发早期的HCV诊断试剂及开发新一代抗病毒药物提供参考。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 慢性丙型肝炎

1．1．1 丙型肝炎病毒的发现及流行病学

1．1．2 丙型肝炎病毒蛋白的基因结构和功能

1．1．3 丙型肝炎病毒生活周期

1．2 丙型肝炎核心蛋白简介

1．2．1 丙型肝炎核心蛋白(core)的结构与功能

1．2．2 丙型肝炎核心蛋白介导的病毒颗粒组装

1．3 核酸适体及其药物的临床研究

1．3．1 核酸适体功能简介

1．3．2 核酸适体药物在临床的研究

1．4 课题的研究意义及设计思路

第2章 HCV核心分段蛋白的表达及纯化

2．1 前言

2．2 实验材料、仪器设备及溶液配制

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器设备

2．2．3 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 原核／真核重组质粒的构建及鉴定

2．3．2 原核重组质粒HCV分段蛋白的小量表达

2．3．3 原核HCV core分段蛋白的大量表达及纯化

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 原核／真核重组质粒的构建及鉴定

2．4．2 分段蛋白的原核小量表达及鉴定

2．4．3 分段蛋白的原核大量表达及纯化

2．4．4 讨论

2．5 本章小结

第3章 检测core核酸适体与核心蛋白的结合区

3．1 前言

3．2 实验材料及仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 丙型肝炎病毒核心蛋白核酸适体识别core蛋白的亲和力鉴定

3．4．2 丙型肝炎病毒核心蛋白核酸适体与core蛋白的结合区鉴定

3．4．3 病人血清中核心蛋白含量与HCV病毒滴度的关系

3．4．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 HCV core核酸适体对病毒生活周期的影响

4．1 前言

4．2 实验材料、仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 HCV core核酸适体对丙型肝炎病毒感染的抑制作用

4．4．2 HCV core核酸适体不诱导HCV感染细胞先天性免疫应答

4．4．3 讨论

4．5 本章小结

第5章 HCV core核酸适体抗病毒作用机制

5．1 前言

5．2 实验材料、仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 core蛋白D1和D2区对病毒感染的影响

5．4．2 核心蛋白核酸适体对病毒组装的影响

5．4．3 讨论

5．4 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢