基于IRE1α/JNK通路研究解毒通络调肝方对内质网应激的影响

摘要

目的:观察解毒通络调肝方对改善T2DM模型大鼠IR的作用及对衣霉素刺激HepG2细胞炎症因子及蛋白表达的影响。
　　方法:1、以长期高脂颗粒料Purina＃5008喂养ZDF大鼠的方法复制实验性2型糖尿病大鼠动物模型。应用中药解毒通络调肝方（高、中、低浓度）对其进行干预，以西药二甲双胍作为阳性药物对照，观察药物对T2DM模型大鼠体质量、尿量、饮水量、糖脂代谢、胰岛素敏感指数及肝组织中IRE1、P-IRE1、JNK，P-JNK、IRS-1及PI3K的表达。2、体外培养HepG2细胞检测解毒通络调肝方不同浓度(12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL)对细胞存活率的影响;以5ug/mL衣霉素刺激HepG2细胞24小时造成内质网应激的模型，应用中药解毒通络调肝方(25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL)对其进行干预，检测炎症因子IL-6、TNF-α及CRP的表达，检测JNK2、IRE-1、NF-κB蛋白表达量。
　　结果:1、对大鼠体质量、饮水量及尿量的影响:西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组体质量虽有下降趋势，但与正常ZL鼠组相比较而言差异仍显著;大鼠饮水量及尿量均明显下降，这与临床上解毒通络调肝方能较好的改善2型糖尿病患者饮水增多，尿量增多的症状相一致。2、对大鼠糖脂代谢的影响:与模型组比较，西药组和解毒通络调肝方高剂量组血糖显著下降，说明西药组和解毒通络调肝方高剂量组在降低血糖，提高胰岛素敏感性、改善抵抗方面对糖尿病大鼠有治疗作用;但西药组与中药高剂量组的糖化血清蛋白及INS与其比较无统计学差异，考虑与用药时间较短有关;与模型组比较，西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组TC、HDL-C及中药高剂量组TG均明显下降;其中解毒通络调肝方高剂量组TG和TC、HDL-C较西药组下降更为明显，说明解毒通络调肝方高剂量组有更好的降脂作用。3、免疫组化方面:对照组ZL鼠无高糖、高脂、肥胖应激状态，肝细胞浆细中无IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达，但模型组、西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组，ZDF鼠存在高糖、高脂、肥胖应激状态，并且给药前肝细胞浆中均有IRE1及P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达，证实了通过给予Purina＃5008高脂饲料，ZDF鼠可诱导形成糖尿病模型;同时与模型组比较给药后西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组肝细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白表达明显减少。证实解毒调肝通络汤及二甲双胍均能通过减少IRE1、P-IRE1、JNK及P-JNK蛋白的表达，抑制IRE1-JNK信号通路，起到改善胰岛素抵抗、减少细胞凋亡的作用;给药后解毒通络调肝方高、中、低剂量组肝细胞胞浆中IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白表达比西药组均减少，且以解毒通络调肝方中剂量组减少较为明显，说明解毒通络调肝方中剂量组有较好的改善抵抗，减少凋亡的作用。4、提高肝组织中IRS-1及PI3K的表达量，增加肝组织对胰岛素的敏感性。5、体外细胞培养方面:对于HePG2细胞而言，解毒通络调肝方12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL，与对照组比较，无统计学差异，证实上述浓度的解毒通络调肝方无细胞毒性;HePG2细胞IL-6，TNF-α、CRP及JNK2，NF-κB及IRE-1少量表达，给予衣霉素刺激后，模型组上述炎症因子及蛋白表达较对照组显著升高，证实了通过给予5ug/ml衣霉素处理24小时可造成HepG2细胞内质网应激的模型;同时，解毒通络调肝方高、中、低剂量组IL-6，TNF-α及CRP表达与模型组比较差异显著，其中IL-6，TNF-α的表达以中药高剂量组降低较为明显，证实了解毒通络调肝方可明显抑制内质网应激状态下HepG2细胞相关炎症因子的表达;在蛋白表达方面，中药中剂量组与高剂量组JNK2、NF-κB及中药高中低剂量组IRE-1表达较模型组明显减少，其中以中药高剂量组减少较为明显，说明中药中剂量组与高剂量组能降低JNK2、NF-κB的表达水平，中药高中低剂量组均可降低IRE-1的表达水平。结果显示，本课题的的结果同文献一致，药物干预后起到了胰岛素增敏剂的作用，可减少HepG2细胞相关炎症因子及蛋白的表达。
　　结论:1、解毒通络调肝方能较好的改善2型糖尿病大鼠饮水量增多，尿量增多，减轻大鼠体重，降低血糖、血脂，提高胰岛素的敏感性。2、解毒通络调肝方能通过减少IRE1、P-IREI、JNK及P-JNK蛋白的表达，抑制IRE1α-JNK信号通路，同时提高IRS及PI3K的相对表达量，从而起到改善胰岛素抵抗、减少细胞凋亡的作用。3、解毒通路调肝方在12.5ug/ml-150ug/ml无细胞毒性。4、解毒通络调肝方可明显抑制内质网应激状态下HepG2细胞炎症因子及相关蛋白的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分 文献综述

综述一 2型糖尿病胰岛素抵抗中医药研究进展

2 消渴病的主要病因病机

3 消渴病的分证论治

4 中医对于络病理论的研究

综述二 现代医学对2型糖尿病发病机制的研究进展

1 我国糖尿病的流行病学研究

2 内质网应激在2型糖尿病发病机制中的研究进展

3 炎症反应、PI3K及胰岛素受体底物与胰岛素抵抗发生的关系

综述三 对于糖尿病动物模型的研究

1 诱发型糖尿病动物模型

2 自发性糖尿病大鼠模型

3 基因敲除动物模型

第二部分 实验研究

实验一 解毒通络调肝方对T2DM大鼠一般情况及糖脂代谢的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

实验二 解毒通络调肝方对2型糖尿病大鼠肝组织中内质网应激相关蛋白表达的影响

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

实验三 解毒通络调肝方对于衣霉素刺激HepG2细胞炎症因子及蛋白表达的影响

1 材料与方法

2 观察指标

3 统计学处理

4 实验结果

5 讨论

参考文献

结语

1 结论

2 创新点

3 存在问题与不足

致谢