核酸探针与工具酶用于生物分子荧光检测的研究

摘要

近年来，核酸探针技术在生物分析领域受到了越来越多的关注。为了建立更加灵敏、便捷的方法来获取生命过程中的各种信息，人们利用核酸探针技术并结合工具酶的催化能力发展了一系列新颖的检测方法。目前基于各种工具酶辅助的核酸探针技术由于具有设计灵活、操作简单、信号转换方式多样化等特点，已经广泛应用于生物工程、临床诊断、食品检测和环境保护等诸多领域。基于此，本文利用核酸探针和工具酶，建立了三种检测生物分子的荧光方法，具体内容如下:
　　1.发展了一种以铜纳米颗粒作为荧光报告团用于检测血小板衍生因子-BB（PlateletDerivedGrowthFactor-BB，PDGF-BB）的方法。设计了一条含有PDGF-BB核酸适配体的探针，当有PDGF-BB存在时，能与核酸探针结合使其发生构型转变，随后引发聚合反应生成双链DNA。双链DNA作为模板合成出能发射荧光的铜纳米颗粒。在优化后的条件下，本方法能实现PDGF-BB的检测，具有较好的灵敏度和选择性，其检测限为4nmol/L。此外，该方法还有望拓展到核酸适配体能发生类似构型转变的一系列其他生物分子的检测。
　　2.基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，并结合核酸外切酶Ⅰ发展了一种检测腺苷的方法。设计了一条末端单标芘的腺苷核酸适配体作为信号探针，当没有腺苷存在时，核酸外切酶Ⅰ能水解探针产生带有芘的单核苷酸。此时，位于单核苷酸上的芘由于空间位阻较小，非常容易嵌入环糊精的疏水空腔内，引起荧光信号的显著增强。而当有腺苷存在时，腺苷与探针结合形成双链结构的复合物，能抵抗核酸外切酶Ⅰ的水解。这时位于探针-腺苷复合物上的芘由于空间位阻很难嵌入环糊精的空腔中，荧光信号明显降低。本方法只需在探针上标记单个荧光基团，探针易于设计，对腺苷的检测限为9μmol/L。
　　3.基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，并结合核酸外切酶Ⅲ的信号放大技术，建立了一种灵敏检测DNA的方法。设计了一条发夹型探针，并在中间位置的碱基上标记芘。有目标DNA存在下，DNA能与发夹型探针杂交形成双链构型，加入核酸外切酶Ⅲ后能逐步水解产生标记了芘的单核苷酸。位于单核苷酸上的芘非常容易嵌入环糊精的疏水空腔内，使得荧光信号显著增强。同时目标DNA能够被重新释放出来，与另一个发夹型探针杂交，引起荧光信号的不断放大。本方法与传统的分子信标相比，不需要淬灭基团的参与，设计新颖，灵敏度和选择性均较好，对DNA的检测限为22pmol/L。

目录

声明

摘要

本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1．1 核酸探针结合工具酶用于分析检测的现状

1．1．1 核酸探针结合工具酶的不同应用目的

1．1．2 常用的工具酶

1．1．3 目前发展的检测体系的复杂程度

1．1．4 目前发展的检测体系的应用对象

1．2 核酸探针结合工具酶在分析检测中的典型应用

1．2．1 基于聚合酶辅助的核酸探针技术

1．2．2 基于连接酶辅助的核酸探针技术

1．2．3 基于外切酶辅助的核酸探针技术

1．2．4 基于限制性内切酶辅助的核酸探针技术

1．2．5 基于切刻酶辅助的核酸探针技术

1．3 本文拟开展的研究工作

第2章 基于双链DNA为模板的铜纳米颗粒用于血小板衍生因子-BB的荧光检测

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 主要仪器和试剂

2．2．2 可行性的考察

2．2．3 实验条件的优化

2．2．4 PDGF-BB的定量检测

2．2．5 PDGF-BB检测选择性的考察

2．2．6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测原理

2．3．2 可行性验证

2．3．3 实验条件的优化

2．3．4 PDGF-BB的定量检测

2．3．5 PDGF-BB检测选择性的考察

2．4 小结

第3章 基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用结合核酸外切酶Ⅰ用于腺苷的检测

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 主要仪器和试剂

3．2．2 β-环糊精聚合物的合成

3．2．3 可行性的考察

3．2．4 实验条件的优化

3．2．5 腺苷的定量检测

3．2．6 腺苷检测选择性的考察

3．2．7 琼脂糖凝胶电泳实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 检测原理

3．3．2 可行性验证

3．3．3 实验条件的优化

3．3．4 腺苷的定量检测

3．3．5 腺苷检测选择性的考察

3．4 小结

第4章 基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用结合核酸外切酶Ⅲ的信号放大技术用于DNA的灵敏检测

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 主要仪器和试剂

4．2．2 β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用考察

4．2．3 可行性的考察

4．2．4 实验条件的优化

4．2．5 DNA的定量检测

4．2．6 DNA检测选择性的考察

4．2．7 琼脂糖凝胶电泳实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 检测原理

4．3．2 β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用考察

4．3．3 可行性验证

4．3．4 实验条件的优化

4．3．5 DNA的定量检测

4．3．6 DNA检测选择性的考察

4．4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢