乙肝病毒转录后调控元件PRE的结构与剪接调控功能的研究

摘要

乙肝病毒的转录后调控元件(PRE)是乙肝病毒中所有的转录本都具有的一段重要调控元件。目前为止发现它的最主要功能是帮助不剪接的HBV转录本preS/S转运到核外，并且近年来也发现PRE具有外显子剪接增强子(ESE)的功能，可以增强HBV pgRNA的剪接。本文继发现PRE的ESE功能后第一次发现PRE可能是一个潜在的内含子剪接沉默子(ISS)，并且其功能可能与自身局部的二级结构和所处的位置有关。 最初通过我室以前构造的ISS报告基因pZW8-SMN1我们发现乙肝病毒的PRE具有很强的抑制SMN1基因外显子7剪接的作用。通过进一步将其序列打断并逐渐恢复长度发现起ISS功能的最短序列是位于PRE3'端的一段长105碱基的片段(pre2bcd)。进一步的实验发现该片段的ISS的功能具有很强的位置依赖性，并且在SMN1基因内含子6距外显子7的3'剪接位点82个碱基处具有最强的效果。通过序列比对我们发现pre2bcd上包含了已经发现的PRE结合蛋白PTB所有的2个结合位点，但两个位点的缺失以及PTB的过表达和下调对pre2bcd在SMN1中的沉默功能没有明显的作用。pre2bcd和其上的两个PTB结合位点的缺失对HBV pgRNA的剪接都没有明显作用。核酸内切酶印迹法(RNase footprinting assay)实验发现pre2bcd可以形成比较有序的二级结构，其主要的结构特征是两个茎环SL1和SL2。本文的这些结果暗示pre2bcd这一功能片段很可能不同于一般的剪接顺式调控元件的机制，而是在通过自身的结构和所处的位置发挥作用。 我们的研究结果证明乙肝病毒的转录后调控元件(PRE)含有可变剪接抑制元件。该剪接元件抑制附近的可变剪接位点的使用。乙肝病毒在该剪接元件具有潜在的3'剪接位点(AG)。我们的结果提示乙肝病毒可能是通过抑制临近可变剪接位点的选择而促进远端剪接位点选择的。

目录

声明

摘要

第一章引言

1．1 mRNA的可变剪接

1．1．1 mRNA剪接的基本方式

1．1．2 mRNA可变剪接的含义和生物学意义

1．1．3可变剪接的类型

1．1．4可变剪接的顺式作用元件与反式调控因子

1．2 HBV的可变剪接和转录后调控元件

1．2．1乙肝病毒的基本概况

1．2．2乙肝病毒的蛋白

1．2．3乙肝病毒RNA的剪接

1．2．4 HBV转录后调控元件(Posttranscriptional Regulatory Element，PRE)

1．3 SMN基因可变剪接

1．3．1 SMA与SMN基因

1．3．2 SMN基因的可变剪接

1．4 mRNA的二级结构和可变剪接

1．4．1 mRNA二级结构调节可变剪接的方式

1．4．2研究RNA二级结构的主要实验方法

1．5．本论文的研究内容和意义

第二章．材料与方法

1．材料

1．1菌株、细胞系及质粒

1．2主要生化试剂

1．3细胞操作相关试剂

1．4酶类

1．5同位素相关

1．6本实验中所用引物

1．7本实验中构建的克隆

1．8分析软件

1．9绘图软件

1．10仪器

1．11溶液的配制

2．方法

2．1普通克隆的构建方法

2．2大肠杆菌感受态的制备与转化

2．3大肠杆菌电转感受态制备与转化

2．4转染用超纯质粒的制备

2．5细胞传代培养

2．6 RT-PCR

2．7放射性PCR检测HBV pgRNA剪接

2．8删除和替代突变克隆的构建

2．9 RNA的制备

2．10标记DNA oligo的方法

2．11核酸酶印迹实验的基本方法(Rnase footprinting assay)

2．12 Westem杂交

第三章．结果和讨论

3．2．HBV PRE在pZW8-SMN1剪接报告基因的内含子里具有可变剪接抑制功能(ISS)

3．2．2 HBV PRE的最小ISS功能片段的确定

3．2．3 PRE2的ISS功能片段具有位置效应

3．2．4反式作用因子PTB对pre2bcd剪接沉默子功能没有明显的调控作用

3．2．5 pre2bcd在HBV pgRNA的主要剪接产物SP1剪接的影响

3．3 HBV PRE ISS功能片段的二级结构的探测

3．3．1 15T的替换突变对pre2bcd功能的影响

3．3．2．核酸内切酶印迹实验探测pre2bcd RNA局部的二级结构

3．4讨论与展望

参考文献

研究生期间发表或待发表论文

致谢