AT1R抑制剂通过下调Notch信号通路对创伤性脑损伤后脑血管自动调节的保护作用研究

摘要

创伤性脑损伤（traumatic brain injure，TBI）是指头部受到直接或间接性的物理或非物理性的撞击或颅骨穿刺伤引起，死亡率和致残率较高，造成沉重的社会和家庭负担。TBI可以不同程度的损伤脑血管自动调节系统中的组织和细胞等，导致脑血管自动调节功能(Cerebrovascular autoregulation，CA)障碍，引起继发性脑损伤。TBI引起的脑组织原发性损伤难以逆转，但对于TBI后的脑血管损伤和脑血流改变等继发性损伤是可以进行干预的。因此通过对TBI后脑血管自动调节功能障碍的机制研究，可以为脑外伤的治疗提供新的理论依据。 目的: (1)用功能核磁共振(functional magnetic resonance imaging，fMRI)评价不同程度TBI大鼠全脑及局部感兴趣区（Region of interests，ROIs）脑血管自动调节功能。(2)探讨AT1R及下游信号通路在TBI后脑血管调节障碍中的作用及机制，为TBI的治疗提供新的理论依据。 方法: (1)用功能核磁共振评价不同程度TBI大鼠脑血管自动调节功能:利用feeney自由落体打击原理制备创伤性脑外伤动物模型:40只雄性SD大鼠(250-300g)随机分为4组:假手术组(Sham，n=10)，轻度TBI组(Mild，n=10)，中度TBI组(Moderate，n=10)，重度TBI组(Severe，n=10)。在TBI后24小时行改良的神经功能评分、水迷宫，随后在腹主动脉瞬间阻断造成血压瞬时变化的状态下，行功能核磁共振检测脑血管自动调节功能，评价不同程度TBI大鼠全脑和局部感兴趣区域脑血管自动调节功能，检测完毕后进行组织学评估(HE染色、尼氏染色、TUNEL)。 (2)探讨Notch信号通路抑制剂DAPT对重度TBI大鼠脑血管自动调节的保护作用及机制:60只雄性SD大鼠(250-300g)随机分为6组:轻度TBI组(Mild，n=10)，中度TBI组(Moderate，n=10)，重度TBI组(Severe，n=10)，重度TBI+vehicle组(Severe+vehicle，n=10)，重度TBI+DAPT组(Severe+DAPT,n=10)。①评价不同损伤程度TBI大鼠Notch及下游信号Hes1、Hes5的蛋白和基因表达情况以及凋亡和氧化应激指标。在TBI24小时检测不同程度TBI大鼠损伤区周围皮质Notch及下游信号Hes1、Hes5的蛋白和基因表达情况，以及凋亡指标:Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9，和氧化应激指标:MDA和SOD。②评价Notch信号抑制剂DAPT对重度TBI大鼠的脑血管自动调节的保护作用及机制。选取重度TBI大鼠用Notch抑制剂进行治疗，用重度TBI和重度TBI+vehicle作为对照组，在TBI24小时后对重度TBI+vehicle组和重度TBI+DAPT组行改良的神经功能评分、水迷宫，随后行功能核磁共振检测脑血管自动调节功能，评价全脑和局部感兴趣区域脑血管自动调节功能，检测完毕后进行组织学评估(HE染色、尼氏染色、TUNEL)，检测损伤周围皮质组织中凋亡指标:Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9，和氧化应激指标:MDA和SOD、Notch和下游Hes1、Hes5表达情况。 (3)探讨AT1R抑制剂对重度TBI大鼠脑血管自动调节的保护作用及机制:30只雄性SD大鼠(250-300g)随机分为3组:重度TBI组(Severe，n=10)，重度TBI+vehicle组(Severe+vehicle，n=10)，重度TBI+Losartan组(Severe+Losartan，n=10)。在TBI24小时行改良的神经功能评分、水迷宫，随后行功能核磁共振检测脑血管自动调节功能，检测损伤周围皮质和海马组织的Notch及下游信号Hes1、Hes5蛋白和基因表达，检测凋亡指标:Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9，和氧化应激指标:MDA和SOD。 结果: (1)在TBI后24小时，重度TBI大鼠在腹主动脉解除阻断后16分钟脑血流仍然处于下降趋势，提示脑血管自动调节功能受损，正常组在腹主动脉解除阻断后4分钟脑血流恢复到基础水平、轻度TBI组和中度TBI组分别在解除阻断后8-12分钟脑血流恢复到基础水平，提示脑血管自动调节功能存在。随着损伤程度加重，Notch及下游信号Hes1、Hes5表达逐渐升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9逐渐升高，抗凋亡因子Bcl-2、逐渐降低，氧化应激指标MDA逐渐升高，SOD下降，各组之间表达具有统计学意义(p＜0.05)。给予Notch抑制剂DAPT治疗后，与TBI组和TBI+vehicle组比较，重度TBI组脑血流在解除阻断后16分钟上升，提示脑血管自动调节功能改善。此外，DAPT治疗组Notch及下游信号Hes1、Hes5表达下降，各组之间比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9下降，抗凋亡因子Bcl-2升高，MDA下降，SOD上升，各组之间比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。DAPT治疗组NSS评分和水迷宫逃避潜伏期均改善，各组差异具有统计学意义(p＜0.05)。 (2)重度TBI组在AT1R抑制剂Losartan治疗后，脑血流在腹主动脉阻断后16分钟开始上升，提示脑血管自动调节功能恢复。Losartan治疗后Notch及下游信号因子Hes1、Hes5下降，差异均具有统计学意义(p＜0.05)。此外，Losartan治疗组促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9下降，抗凋亡因子Bcl-2升高，MDA下降，SOD上升，各组之间比较差异具有统计学意义(p＜0.05)。Losartan治疗组NSS评分和水迷宫逃避潜伏期均改善，各组差异具有统计学意义(p＜0.05)。 结论: (1)重度TBI大鼠在TBI后24小时全脑和局部感兴趣区域脑血管自动调节功能受损(2)AT1R抑制剂Losartan可以通过抑制Notch及下游信号减轻凋亡和氧化应激，改善重度TBI大鼠脑血管自动调节功能。

目录

声明

英文缩略名词对照表

摘要

第一部分功能核磁共振评价不同程度创伤性脑损伤大鼠脑血管自动调节功能

1前言

2材料与方法

2．1实验材料

2．2试验方法

2．3统计学分析

3结果

3．1不同程度创伤性脑损伤大鼠神经功能评分

3．2水迷宫

3．3不同程度TBI大鼠组织病理改变和磁共振下T2WI改变

3．4不同程度TBI大鼠TUNEL表现

3．5不同程度TBI大鼠全脑血流及脑血管自动调节功能

3．6不同程度TBI大鼠局部感兴趣区(左右海马、左右皮质)脑血流及脑血管自动调节功能

4讨论

5小结

第二部分Notch信号通路参与创伤性脑损伤大鼠脑血管自动调节中的作用及机制

1前言

2材料和方法

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3统计学分析

3结果

3．1不同程度TBI大鼠Notch信号及下游信号分子蛋白和mRNA表达增高

3．2 Notch抑制剂DAPT可以改善重度TBI大鼠神经功能评分

3．3 Notch抑制剂DAPT可以改善重度TBI大鼠水迷宫逃避潜伏期

3．4 Notch抑制剂DAPT可以减轻重度TBI大鼠的病理损伤

3．5 Notch抑制剂DAPT可以改善重度TBI大鼠脑血管自动调节功能

3．5．3左侧皮质CBF及脑血管自动调节功能

3．5．4右侧皮质CBF与脑血管自动调节功能

3．6 Notch抑制剂DAPT可以减轻重度TBI大鼠脑组织氧化应激水平

3．7 Notch抑制剂DAPT可以减轻重度TBI大鼠脑组织凋亡水平

4讨论

5小结

第三部分AT1R抑制剂通过下调Notch信号通路改善重度创伤性脑损伤大鼠脑血管自动调节功能

1前言

2材料和方法

2．1实验材料

2．2实验方法

2．3统计学分析

3结果

3．1 AT1R抑制剂可以改善重度TBI大鼠脑血管自动调节功能

3．2 AT1R抑制剂下调Notch信号及下游信号分子Hes1、Hes5的蛋白和基因表达

3．3 AT1R抑制剂改善重度TBI大鼠NSS

3．5 AT1R抑制剂减轻重度TBI大鼠凋亡反应

3．6 AT1R抑制剂减轻重度TBI大鼠氧化应激水平

4讨论

5结论

参考文献

综述

博士期间发表论文

致谢