KaiB单体-二聚体转换在KaiA-KaiB-KaiC生物钟反应体系中的作用的初步研究

摘要

目的:以蓝藻PCC7942生物钟蛋白KaiA,KaiB,KaiC为研究对象,初步探索KaiA-KaiB-KaiC蛋白体外反应体系中KaiB蛋白聚合体是否有单体二聚体形式转换过程,其聚合体状态对KaiA-KaiB-KaiC反应体系是否有影响?如何影响?以期解决KaiA-KaiB-KaiC蛋白体外反应体系中KaiB参与的过程中一些不清楚的问题,从蛋白质相互作用方面为我们更好地解析蓝藻体外核心生物振荡体系的运转机制提供借鉴,也为真核生物的生物钟研究提供启示。
　　方法:(1)通过蛋白质分析序列比对软件,结构分析软件,参考文献分析KaiB的特征。(2)利用KaiA,KaiB,KaiC原核质粒表达高纯度的KaiA,KaiB, KaiC蛋白,用亲和层析,离子交换层析进行蛋白纯化,并对其一般理化性质,聚合状态进行初步鉴定。(3)得到高纯度的KaiA,KaiB,KaiC蛋白后体外重组KaiA-KaiB-KaiC反应,验证KaiA,KaiB,KaiC活性。(4)用蛋白相互作用仪器测KaiA,KaiB,KaiC不同形式的相互作用常数。(5)根据KaiB蛋白的特征,设计及构建特定聚合体状态的KaiB蛋白表达质粒,分别命名为dimerkaib,kaibL47C(6)表达纯化dimerKaiB,KaiB-L47C蛋白,用SDS-PAGE,PAGE,分子筛分析对其初步理化性质,聚合状态进行研究。(7)分别用dimerKaiB,KaiB-L47C蛋白和KaiA,KaiC进行相互反应,研究其对体外生物振荡体系的磷酸化影响。(8)用蛋白相互作用仪器测KaiA,dimerKaiB/KaiB-L47C,KaiC不同形式的相互作用常数。
　　结果:(1)成功纯化出高纯度的KaiA,KaiB,KaiC蛋白。(2)KaiA-KaiB-KaiC体外相互作用磷酸化实验表明纯化的KaiA,KaiB,KaiC有一定的活性,体外磷酸化振荡体系初步建立。(3)成功构建特定聚合体状态的KaiB蛋白表达质粒dimerkaib和kaibL47C。(4)表达纯化出dimerKaiB蛋白,并对其一般理化性质研究;PAGE电泳实验表明其行为不同于KaiB,dimerKaiB4和dimerKaiB5 PAGE电泳表现不同的电泳特性,分析柱分析dimerKaiB蛋白分子量比KaiB四聚体状态大一点点约为55.9 kD+/-5.9kD。(5)初步的dimerKaiB和KaiA,KaiC磷酸化相互反应实验表现为KaiC失去明显的磷酸化振荡。(6)得到GST-dimerKaiB和KaiC的相互作用常数为KD=3.385e-10M,ka=7.31e7(1/Ms),kd=2.474e-2(1/s)。
　　结论:(1)成功建立起纯化KaiA,KaiB,KaiC蛋白的方法,能得到高纯度和一定活性的KaiA,KaiB,KaiC蛋白。(2)初步建立起KaiA-KaiB-KaiC体外磷酸化相互反应体系。(3)构建出了特定状态的KaiB蛋白,蛋白设计与实验符合程度较大。从特定状态的KaiB的性质、动力学常数、磷酸化振荡等实验初步证明KaiB参与KaiA-KaiB-KaiC体外磷酸化振荡体系时,其会出现聚合体-单体转换过程,KaiB单体出现的过程是其和KaiC发生直接相互作用的必要条件。

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英文缩略词表

引言

材料与方法

1.主要仪器和设备

2.主要实验材料及试剂

3. 实验方法

结果

第一部分：KaiA，KaiB，KaiC 质粒核对，蛋白纯化结果

第二部分：KaiA-KaiB-KaiC蛋白体外重组磷酸化振荡反应结果

第三部分：KaiB改造后蛋白质粒构建及蛋白表达纯化

第四部分：dimerKaiB上分析柱结果

第五部分：改造后KaiB蛋白对KaiA-KaiB-KaiC体外相互反应体系的影响研究

讨论

对dimerKaiB的电泳行为讨论

用NHS-EDC 非特异性交联KaiA，KaiB的实验讨论

KaiA-KaiB-KaiC 相互反应的实验讨论

对GST-dimerKaiB-KaiC相互反应动力学常数测定实验讨论

KaiA-dimerKaiB-KaiC 相互反应的讨论

dimerKaiB的实验研究中的一些结果讨论

KaiA，KaiC相关性质讨论

推测与假说，及实验扩展

用重叠延伸PCR进行质粒定点突变，构建KaiB-L47C

kaibL47C 质粒构建结果

小结

参考文献

综述

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著