SUMO修饰蛋白在分枝杆菌感染中的动态变化及抗海分枝杆菌天然化合物的初筛

摘要

目的：
　　（1）研究小泛素样修饰物（SUMO）修饰蛋白在分枝杆菌感染金鱼动物模型中的动态变化，探讨 SUMO修饰与分枝杆菌致病的关系。
　　（2）在26种天然单体化合物中筛选出具有抗海分枝杆菌的天然单体化合物。
　　方法：
　　（1）金鱼90条，随机分为WT野生组30条，分枝杆菌细胞壁脂质结核菌醇二分枝菌酸（PDIM）突变组（FAD）30条，PBS对照组30条，将浓度为10^8 cfu/mL的菌悬液于金鱼泄殖腔附近进行腹腔注射，每条鱼注射100μL，建立海分枝杆菌感染金鱼模型，对照组金鱼注射等量的无菌PBS溶液。通过HE、抗酸染色验证该动物模型，观察组织肉芽肿的形态。采用免疫组织化学染色对IL-6的表达进行定位和相对定量，应用Western Blot技术检测IL-6、SUMO-1、UBC-9蛋白的表达。通过RT-PCR技术检测TNF-α、IL-12、SUMO-1、UBC-9、SENP-1 mRNA表达水平变化。
　　（2）采用倍比稀释法进行海分枝杆菌体外药物敏感试验，测定天然单体单独使用和与利福平联合应用时对海分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC），并根据公式计算出部分抑菌浓度（FIC）值，判断是否与利福平有协同作用。
　　结果：
　　（1）成功建立海分枝杆菌感染金鱼模型。
　　（2）HE染色及抗酸染色结果显示，金鱼感染海分枝杆菌后有典型的类结核肉芽肿形成。镜下见肉芽肿组织内有大量海分枝杆菌存在。PBS对照组金鱼均无肉芽肿结构形成，也未见海分枝杆菌存在。
　　（3）免疫组织化学染色与Western Blot结果显示，与PBS对照组比较，金鱼在感染海分枝杆菌（WT和FAD组）后细胞因子IL-6表达增加，其中，WT组比FAD组增加更显著。蛋白SUMO-1与UBC-9表达均有所升高，WT组比FAD组表达升高明显，差异具有统计学意义。
　　（4）RT-PCR结果显示，与 PBS对照组比较，WT组与FAD组的TNF-α、IL-12 mRNA表达增加，且WT组表达增加更明显。SUMO-1、UBC-9 mRNA表达水平均升高，WT组升高更显著。与PBS对照组比较，WT组与FAD组SENP-1 mRNA表达水平均降低，WT组表达降低更明显，差异有统计学意义。
　　（5）单独体外药物敏感试验结果显示：8种天然单体JM271、SDXQ2、SDXQ9、J43233、J22-1、Compound-1、SDX28、G565有一定抗海分枝杆菌活性。联合药物敏感试验结果显示，4种天然单体化合物SDX28、G565、H208、ZXQ4p-1与利福平有不同程度的协同作用。
　　结论：
　　（1）分枝杆菌感染金鱼后，可能通过其细胞壁脂质成分 PDIM/PGL调控SUMO修饰通路，介导炎性介质（如TNF-α、IL-6及IL-12等）表达上调，从而形成炎性肉芽肿，导致病变。
　　（2）本实验初步筛选出了8种（JM271、SDXQ2、SDXQ9、J43233、J22-1、Compound-1、SDX28、G565）具有抗海分枝杆菌的天然单体化合物，且发现其中4种药物（SDX28、G565、H208、ZXQ4p-1）与利福平有协同作用。

目录

声明

英文缩略词表

引言

1.1.1实验动物

1.1.2菌株

1.1.3药物

1.1.4引物

1.1.5实验试剂

1.1.6主要实验仪器与设备

1.2 实验方法

1.2.1海分枝杆菌的培养

1.2.2抗酸染色鉴定海分枝杆菌

1.2.3建立海分枝杆菌感染金鱼模型

1.2.4金鱼组织切片HE染色观察肉芽肿的形态结构特点

1.2.5免疫组织化学染色检测组织蛋白表达

1.2.6 Western Blot检测金鱼肝脏组织IL-6、SUMO-1、UBC-9蛋白表达水平

1.2.7逆转录PCR检测相关基因mRNA表达

1.2.8抗海分枝杆菌天然单体化合物的筛选

1.3 统计学处理

结果

1.1 海分枝杆菌在7H10平板的菌落形态

1.2 海分枝杆菌抗酸染色镜下特点

1.3 金鱼感染海分枝杆菌后一般情况

1.4 金鱼组织石蜡切片HE染色病理形态学观察

1.5 金鱼肝、脾、肾组织石蜡切片抗酸染色

2.1 免疫组织化学染色检测金鱼组织IL-6表达变化

2.2 Western Blot检测组织IL-6、SUMO-1、UBC-9蛋白表达变化

2.3 RT-PCR检测炎性因子TNF-α、IL-12 mRNA表达水平

2.4 RT-PCR检测SUMO修饰通路分子SUMO-1、UBC-9、SENP-1 mRNA表达水平变化

3.1 单独药物敏感试验

3.2 联合药物敏感试验

1 海分枝杆菌感染金鱼模型的建立

2 SUMO修饰蛋白在分枝杆菌感染过程中的动态变化

3 抗海分枝杆菌活性天然单体化合物的筛选

结论

参考文献

综述:结核肉芽肿的研究新进展

后记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著