UCH-L1在tau蛋白聚集体形成过程中的作用及机制研究

摘要

泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是生物体最受关注的蛋白质清除系统，参与异常蛋白质的清除。当蛋白酶体功能受损时，异常蛋白质无法通过泛素蛋白酶体系统进行有效地清除，此时体内另一条蛋白质清除系统一自噬溶酶体系统(autophagy-lysosomal system，ALS)将被代偿性地激活。泛素蛋白聚集物和组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase6，HDAC6)以及动力蛋白dynein形成复合物，通过微管网络募集并运往微管组织中心形成蛋白质聚集体。蛋白质聚集体的形成是蛋白聚集物经自噬溶酶体途径降解的关键步骤。泛素C末端水解酶L1（ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1，UCH-L1）是去泛素化酶中UCH家族的重要一员，不仅具有泛素水解酶活性，还具有泛素连接酶活性，对神经元的存活及维持神经元的正常功能具有重要作用。UCH-L1功能异常与神经退行性疾病密切相关，如帕金森病和阿尔茨海默症，这些疾病都存在着蛋白质清除障碍，有研究显示抑制UCH-L1活性会导致tau蛋白的异常聚集，但目前关于UCH-L1在蛋白质聚集体经自噬溶酶体途径降解的作用及相关分子机制尚不明确。有报道证明去泛素化酶可产生K63连接的泛素链，K63连接的泛素链与HDAC6的泛素锌指结构域结合并激活HDAC6活性，从而促进蛋白质聚集体形成并激活自噬溶酶体途径。因此，我们大胆推测，UCH-L1作为去泛素化酶可能通过产生K63连接的泛素链，激活HDAC6活性，促进聚集体的形成;当UCH-L1功能异常时，K63连接的泛素链缺乏将导致聚集体形成受阻。
　　目的:利用蛋白酶体抑制剂MG132诱导tau蛋白聚集体形成，同时抑制UCH-L1的活性，探讨UCH-L1在tau蛋白聚集体形成过程中的作用及分子机制。
　　方法:MG132单独处理组用3μM的蛋白酶体抑制剂MG132处理HEK293/tau441细胞8hr，MG132和LDN共同处理组先用3μM的MG132预处理2hr，再加入5μM的UCH-L1抑制剂LDN继续处理6hr，整个药物处理过程选取DMSO作为实验对照。药物处理结束后，通过免疫印迹、免疫荧光和免疫沉淀技术检测相关分子生化指标。
　　结果:(1)与对照组相比，用MG132单独处理以及用MG132和LDN共同处理，细胞中的多聚泛素含量均明显增多(P＜0.05)，单体泛素含量均明显减少(P＜0.01);与MG132组相比，用MG132和LDN共同处理细胞时，单体泛素含量有所减少(P＜0.05)。(2)当MG132处理细胞时，tau蛋白、vimentin和ubiquitin均向近核区聚集，tau蛋白与vimentin以及tau蛋白与ubiquitin呈现明显的共定位，并在核周形成明显聚集体结构;当MG132和LDN共同处理时，tau蛋白聚集体形成明显受到抑制。(3)免疫沉淀结果显示，与对照组相比，用MG132处理细胞时，HDAC6与tau蛋白的亲和力显著增强(P＜0.001);当MG132和LDN共同处理细胞时，与MG132单独处理组相比，两者的结合明显减弱(P＜0.01)。(4)与对照组相比，MG132单独处理组和MG132及LDN共同处理组均引起HDAC6的表达含量增加，但两处理组之间无明显差异;同时与对照组相比，MG132单独处理组ac-tubulin含量明显下降(P＜0.05)，表明抑制蛋白酶体活性后，HDAC6的活性代偿性增强，而与MG132组相比，MG132和LDN共同处理组ac-tubulin含量显著增加(P＜0.01)。(5)与对照组相比，MG132单独处理组K63-Ub含量显著增加(P＜0.01);MG132和LDN共同处理组K63-Ub含量有所减少(P＜0.05)，且明显低于MG132处理组(P＜0.01)。(6)免疫沉淀结果显示，与对照组相比，抑制蛋白酶体活性后，HDAC6与K63-Ub结合作用增强(P＜0.01)，同时用LDN抑制UCH-L1活性后，细胞中HDAC6与K63-Ub的结合力减弱(P＜0.05)，且两者的结合减弱程度相比于MG132组更为显著(P＜0.01)。
　　结论:上述结果表明，当蛋白酶体活性受损时，HDAC6通过增强与K63-Ub的结合而激活自身活性，并增强与tau蛋白的亲和力，参与tau蛋白聚集体的形成。然而，蛋白酶体功能受损的同时UCH-L1的活性也受到抑制，K63-Ub的生成会减少，HDAC6与K63-Ub的结合能力减弱，使得自身活性下调，同时HDAC6与tau蛋白结合能力减弱，导致tau蛋白聚集体形成受阻。
　　本研究初步探讨了UCH-L1在tau蛋白聚集体形成中的作用，为进一步明确UCH-L1在神经退行性疾病的作用及机制提供了较好的实验依据。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 微管相关蛋白tau

1．1．1 tau蛋白的结构与功能

1．1．2 tau蛋白与阿尔茨海默症

1．2 蛋白质的降解系统

1．2．1 泛素蛋白酶体系统

1．2．2 自噬溶酶体系统

1．2．3 泛素在蛋白质降解中的作用

1．3 组蛋白去乙酰化酶6

1．3．1 HDAC6的结构与功熊

1．3．2 HDAC6对蛋白质降解过程的调控

1．4 泛素C末端水解酶L1

1．4．1 UCH-L1的结构与功能

1．4．2 UCH-L1与阿尔茨海默症

1．5 本研究的目的及意义

2．材料与方法

2．1 实验仪器

2．2 化学试剂及抗体

2．2．1 主要化学试剂

2．2．2 抗体

2．3 细胞传代培养

2．4 细胞加药处理

2．5 免疫印迹

2．5．1 细胞蛋白样品的制备

2．5．2 BCA法测蛋白质浓度

2．5．3 SDS-PAGE凝胶电泳

2．5．4 转膜

2．5．5 显色

2．6 免疫荧光

2．7 免疫沉淀

2．8 数据分析

3．实验结果

3．1 蛋白酶体活性抑制时，LDN处理导致泛素水平异常

3．2 抑制UCH-L1的活性导致泛素化tau蛋白聚集体形成受阻

3．3 抑制UCH-L1的活性，HDAC6与tau蛋白的结合能力下降

3．4 LDN处理对HDAC6活性的影响

3．5 聚集体形成过程中，抑制UCH-L1的活性导致Lys 63 Ub水平下降

3．6 抑制UCH-L1的活性导致HDAC6与Lys 63 Ub结合能力下降

4．讨论

4．1 UCH-L1的活性与多聚泛素化tau蛋白聚集体形成的关系

4．2 UCH-L1的活性与HDAC6和tau蛋白亲和力的关系

4．3 UCH-L1的活性与HDAC6活性的关系

5．结论与展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢