3-羟基黄酮类ESIPT荧光探针用于氧还信号通路关键小分子(H2O2和GSH)检测的研究

摘要

人和动物机体内，伴随细胞呼吸和能量代谢，时刻发生着有氧氧化。与此同时，细胞产生活性氧分子(ROS)。当细胞受到内外环境的刺激时，ROS产生增多，从而破坏机体氧化与抗氧化系统之间的平衡，最终导致氧化应激。氧化应激被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。在机体中，与氧化还原相关的活性小分子能够协同调节细胞的氧化还原状态，这对维持细胞正常的内稳态至关重要。细胞中相对稳定且含量较高的ROS为H2O2，而具有代表性的还原性物种为谷胱甘肽(GSH)。检测细胞内二者的水平，能在一定程度上反映细胞所处的氧化还原状态，通过研究胞内的氧化应激状态，可应用于对抗氧化药物的药效进行评估。
　　荧光传感器由于具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、易于修饰等优点，近年来被广泛用于细胞内小分子的检测。激发态分子内质子转移(ESIPT)的荧光传感器凭借其较高的荧光量子产率、较大的Stokes位移以及具有两个荧光发射峰、可通过双波长比率检测等特性近年来逐渐受到人们的关注。3-羟基黄酮(3HC)类化合物是一类典型的具有ESIPT机制的荧光化合物，对外部微环境的极性变化非常敏感。已被广泛应用于核酸、蛋白质、聚合物以及磷脂质囊泡等生物大分子的研究。
　　本论文以3HC为母体荧光团，在溶液中进行的荧光实验结果显示，富含α-螺旋结构的蛋白质牛血清白蛋白(BSA)提供的疏水微环境中可以增强3HC的ESIPT效应，导致体系出现两个荧光发射峰。激光扫描共聚焦显微镜实验结果证实，该母体荧光团在富含蛋白质的细胞中发射的荧光较强。因此，在3HC母体上分别修饰上H2O2的检测基团硼酸频哪醇酯，和GSH的检测基团2，4-二硝基苯磺酰，得到比率计荧光探针3HC-18-1和3HC-19-2。二者被用于检测溶液中的H2O2和GSH时，由于检测基团被靶分子切割，得到3HC母体并在BSA存在的溶液中发射荧光，从而实现对靶分子的“Turn-on”型检测。实验结果显示，3HC-18-1和3HC-19-2均具有很高的灵敏度和较好的选择性，并都能应用于Hela细胞中H2O2和GSH的检测。
　　此外，还进一步在3HC上修饰上线粒体靶向基团——季铵化的吡啶基团，得到新的母体荧光团3HC-11，激光共聚焦实验证实其可以靶向线粒体并在富含蛋白质等生物大分子的细胞中发射荧光，这为下一步发展靶向线粒体荧光探针提供基础。

目录

声明

摘要

本论文主要创新点

第一章 绪论

1．1．2 ROS的来源及作用

1．1．3 抗氧化剂GSH在体内的分布及作用

1．1．4 ROS及抗氧化剂的检测方法

1．2 荧光探针的发光机制及生物学应用

1．2．1 荧光探针母体及其发光机制

1．2．2 H2O2荧光探针的发展现状

1．2．3 GSH荧光探针的发展现状

1．2．4 靶向线粒体荧光探针的发展现状

1．2．5 比率型荧光探针的特点及应用

1．3 ESIPT类荧光分子的特点及应用

1．3．1 ESIPT过程及特点

1．3．2 ESIPT分子与生物大分子的相互作用及应用

1．4 本论文选题意义及研究目的

1．4．1 选题背景及意义

1．4．2 课题研究内容

第二章 3-羟基黄酮类荧光探针的合成与表征

2．1 引言

2．2 3-羟基黄酮类荧光探针及其合成路线

2．3 实验部分

2．3．1 试剂与材料

2．3．2 仪器与器材

2．3．3 荧光探针的合成及表征

2．4 小结

第三章 3-羟基黄酮类荧光探针在溶液中光谱性质的测试

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 仪器与器材

3．3．1 3-羟基黄酮类荧光分子与蛋白质(BSA)相互作用光谱性质

3．3．2 3-羟基黄酮类用于检测H2O2荧光探针的光谱性质

3．3．3 3-羟基黄酮类用于检测GSH荧光探针的光谱性质

3．4 小结

第四章 荧光探针的细胞成像检测

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与材料

4．2．2 仪器与器材

4．3 细胞培养

4．4 细胞毒性实验

4．5 荧光探针细胞成像实验

4．5．1 荧光母体倒置荧光显微镜成像

4．5．2 3HC-18及3HC-18-1共聚焦成像

4．5．3 3HC-19-2共聚焦成像

4．5．4 3HC-11靶向线粒体共聚焦成像

4．6 小结

5．1 主要研究结果

5．2 课题展望

参考文献

附录

致谢