金黄色葡萄球菌B型肠毒素的溶液构象及菌体生长环境效应

摘要

金黄色葡萄球菌(Saphylococcusaureus)是人类和某些动物的病原菌之一，其致病力强弱主要取决于产生的毒素和侵袭性酶的能力，其中金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素，是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主要原因，因此，这方面的研究已成为科学家们普遍关注的重要课题。本文以主要产B型肠毒素的金黄色葡萄球菌S6菌株为研究对象，采用X-射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、分子振动光谱(红外、激光拉曼)、圆二色谱、荧光光谱等现代分析技术表征金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcalenterotoxinB，简称SEB)的聚集态结构、三维立体形貌、分子链构象及蛋白质二级结构组成。同时着重研究了肠毒素在稀溶液状态和外界环境改变时的构象特征及可能的去折叠过程，尝试用蛋白质构象理论揭示肠毒素耐热的根本原因，寻找其耐热的可能优势构象，建立研究蛋白质构象与生物学活性相关性的新方法。此外，还从酸奶发酵菌株和金黄色葡萄球菌的混合培养特性出发，研究了乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制作用及其在抑制过程中热效应的微量变化，从热化学的角度探讨其作用机制。主要研究结果如下： 1.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的分离纯化采用玻璃纸覆盖琼脂平板法培养金黄色葡萄球菌，首先利用羧甲基纤维素阳离子CM-32柱层析，对B型肠毒素进行初步分离富集，然后依据筛分原理按分子量大小经SephadexG-75凝胶进一步纯化，得到电泳纯B型肠毒素，得率为26.8％，紫外吸收光谱测得其特征吸收峰为276.6nm，SDS-PAGE凝胶电泳分析其相对分子质量为2.8×104，与文献报道值一致。 2.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的结构表征利用X-射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、傅里叶变换红外光谱、激光拉曼光谱等现代分析手段对金黄色葡萄球菌B型肠毒素的聚集态结构、分子链形态，二级结构等进行了表征。结果表明，SEB为一种单纯蛋白，其聚集态包含结晶区和无定形区，结晶度为37.8％，其分子聚集在一起，形态主要为片状和平板状，具有一定的规整性。原子力显微镜首次观察到SEB在稀溶液状态下的单分子链长度约为1500nm，分子链宽度约为20～40nm，分子链高0.6nm。SEB的傅里叶变换红外光谱和激光拉曼光谱分析表明，SEB的二级结构单元主要为B-折叠和α-螺旋，无规卷曲含量较少，侧链C-C-S-S-C-C构型为反式－扭曲－反式。 3.金黄色葡萄球菌B型肠毒素的稀溶液构象及去折叠作用研究大分子的溶液构象和蛋白质的去折叠作用是近来揭示蛋白质生物活性及其与高级结构相关性的重要切入点。金黄色葡萄球菌B型肠毒素水溶液(浓度为0.02mol/L)在25℃的远紫外CD谱显示，其二级结构各构象单元含量分别为：α-螺旋22.6％、β-折叠40.4％、转角19.2％和无规卷曲17.7％，说明SEB属于β-折叠含量较高的蛋白质。在50～121℃温度范围内，随着温度的升高，SEB二级结构中的α-螺旋含量逐渐下降，从25℃时的22.6％降为95℃的9.6％，在121℃时，α-螺旋完全消失。同SEB二级结构中α-螺旋变化相反，β-折叠含量则相对保持稳定，仅在75℃时其含量为8.5％，而在其它温度处理下，含量均在30.2％以上，121℃时仍保持39.9％，温度变化(除了75℃外)几乎不能引起SEB去折叠，由此说明β-折叠是保持SEB二级结构稳定性的优势构象单元。SEB经121℃处理后的激光拉曼光谱显示，表征其二级结构的α-螺旋和二硫键谱带消失，而在1672cm-1处仍保持β-折叠的特征谱带，同样证实SEB是一种热稳定性强的蛋白质，从分子水平探讨了肠毒素热稳定性的机理，这一结论未见文献报道。 本实验通过CD和荧光光谱分析研究了SDS、脲和乳酸链球菌素对稀溶液中SEB构象的影响。实验表明，SDS和乳酸链球菌素均能使SEB构象单元中的α-螺旋含量下降，B-折叠和无规则卷曲含量增加，但仍然保持β-折叠的主导结构，说明SDS和乳酸链球菌素对SEB不具有减毒或灭活作用。脲的作用相反，它能使SEB二级结构中的α-螺旋构象单元的含量显著增加，而β-折叠和无规则卷曲消失，转化为转角结构，起到去折叠的作用，从而证实了脲处理并不能使变性的肠毒素恢复活性而有利于检测这一推测。 荧光光谱研究表明，在不同浓度脲的作用下(脲浓度依次为0、0.1、1、2、3、4、5、6mol/L)，随着脲浓度的增加，SEB分子中的Trp进入疏水环境，荧光量子产率降低，荧光强度减弱；而在不同浓度SDS和乳酸链球菌素作用下，随着SDS和乳酸链球菌数浓度的增加，SEB分子中的Trp进入亲水环境，荧光强度增强。30％乙醇和30％甘油分别使SEB内源荧光强度增强29.9％和461.0％，最大发射波长保持不变，其作用效果和SDS一致。SEB对Nisin荧光光谱影响不大，Nisin荧光光谱的最大发射峰位置基本没有发生变化，相对荧光强度仅有微弱的增强，说明SEB与Nisin相互作用时，仅有较小的能量转移。 4.金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗体的制备及间接竞争ELISA检测方法的建立以Balb/c小鼠为免疫对象，采用小剂量长周期免疫方案，多点多次注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素，待小鼠血清效价达到要求后，腹腔注射P2/0骨髓瘤细胞抽取腹水制备抗体，间接ELISA测定抗体效价可达1：105左右，具有实际应用价值。 以自制抗原和抗体建立的金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争ELISA方法的最低检测量为1ng/mL，线性检测范围为1～103ng/mL，相关系数R2=0.9951，对人工污染样品的平均回收率为94.5％。 5.乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌抑制作用研究表明，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和金黄色葡萄球菌共培养时，由于环境pH值的降低、抗微生物因子的存在及微生物之间的营养竞争作用，使得金黄色葡萄球菌的生长受到了抑制。乳酸、乙酸和过氧化氢均对金黄色葡萄球菌的生长有较强的抑制作用，且随着含量的增加，抑制作用增强。乳酸和乙酸对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于无机酸(盐酸)，pH3.5时，三种酸均可显著抑制金黄色葡萄球菌的生长。乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌的抑制作用与浓度呈正相关，y=0.8025x+5.12，R2=0.9939。 6.乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌抑制作用的微量热学研究首次采用微量热法研究乳酸链球菌素(Nisin)对金黄色葡萄球菌的抑制作用。在Nisin作用下，金黄色葡萄球菌的生理、生化和代谢特征均发生了变化。结果表明，随着Nisin浓度的增加，金黄色葡萄球菌的生长速率常数降低、传代时间延长，且Nisin浓度越高，其作用越明显。金黄色葡萄球菌的生长速率常数(k)和Nisin的浓度(c)之间的关系式为k=0.0377-3.988×10-4c，R=-0.9971，Nisin对金黄色葡萄球菌的半数抑制浓度为48.05IU/mL，金黄色葡萄球菌的临界生长浓度值为94.53IU/mL。微量热法所反映的生长速率常数、传代时间、半数抑制浓度和临界生长浓度值均可作为评价Nisin抑菌作用的一个定量指标，同样可用于评价其它细菌素对微生物的生物活性作用。此方面的研究尚未见文献报道。 7.金黄色葡萄球菌在酸奶中生态学初步研究金黄色葡萄球菌在酸奶中的初步生态学研究表明，原料乳中金黄色葡萄球菌初始接种量对其生存能力有决定性的影响。原料乳中金黄色葡萄球菌初始接种量分别为1.8×10、1.8×102cfu/mL时，在酸奶发酵与冷藏过程中均未检测出金黄色葡萄球菌，且成品酸奶中金黄色葡萄球菌耐热核酸酶、肠毒素的检测均为阴性；原料乳中金黄色葡萄球菌的接种量分别为8.5×103、2.7×104、2.7×105、1.8×106cfu/mL时，在酸奶发酵过程中，金黄色葡萄球菌菌数呈明显上升趋势；而冷藏过程中，金黄色葡萄球菌菌数呈逐渐下降趋势，成品酸奶中耐热核酸酶活性星阳性，B型肠毒素含量分别为0、6.5、38.5和77.9ng/mL。实验结果表明，当原料乳中金黄色葡萄球菌污染严重时，酸奶生产发酵过程中的低pH值环境及代谢产物不足以抑制金黄色葡萄的生长繁殖与产毒，食用该食品有导致葡萄球菌食物中毒的可能性。

目录

文摘

英文文摘

前言

1金黄色葡萄球菌

1.1生物学特性

1.2金黄色葡萄球菌的致病性

1.3金黄色葡萄球菌分型

1.4抵抗力

1.5金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒

1.6金黄色葡萄球菌的检测

1.7食品中金黄色葡萄球菌的生长与生态

2金黄色葡萄球菌肠毒素

2.1金黄色葡萄球菌肠毒素的分子组成

2.2金黄色葡萄球菌肠毒素的结构

2.3金黄色葡萄球菌肠毒素的理化性质

2.4影响金黄色葡萄球菌肠毒素产生的因素

2.5肠毒素的分离和纯化

2.6金黄色葡萄球菌肠毒素的检测

3课题构想

3.1本课题的研究目的和意义

3.2主要研究内容

3.3本研究的特色

参考文献

上篇金黄色葡萄球菌B型肠毒素的溶液构象

第一章金黄色葡萄球菌B型肠毒素的分离纯化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第二章金黄色葡萄球菌B型肠毒素的结构表征及稀溶液中构象变化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第三章金黄色葡萄球菌B型肠毒素抗血清的制备及酶联检测方法的建立

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

上篇小结

下篇金黄色葡萄球菌生长的环境效应

第四章乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌抑制作用的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第五章乳酸链球菌素对金黄色葡萄球菌抑制作用的微量热学研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

第六章金黄色葡萄球菌在酸奶中生态学的初步研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

参考文献

下篇小结

文献综述 仪器分析技术在蛋白质结构研究中的应用进展

致谢

附表一英文缩略词