柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究

摘要

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界性柑橘生产上的毁灭性病害。易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎叶病；病原分别为Citrus tristeza virus(CTV)，Citrus exocortis viroid(CEVd)．Citrus tatter leaf virus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV为对象，从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究；目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系；在分子水平上明确其部分分子特性。另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及机理。主要获得结果如下： 1．HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化。以长春花和桠柑为指示植物，部分 待检材料表现了明显HLB症状。通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整， 建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测技术；并对三种方 法的检测灵敏度进行比较，结果发现Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测灵敏 度远高于常规PCR，是常规PCR的10<'4>倍。运用Nested-PCR技术在黄皮上检测 出HLB病菌(Candidatus Liberobacter asiaticus)，在国内外属于首次报道。 2．不同引物检测HLB病菌灵敏度比较。对基于rplA／rplK，β-operon，16SrDNA和 16S／23SrDNA不同基因组序列设计的5对引物依次为fP400／rP400，fP535／rP535， fA2／rJ5，fOll／rOl2c，fOl2／r23S1检测HLB病菌灵敏度进行了比较，结果发现不 同引物检测灵敏度不一样，其检测灵敏度由高到低依次为：fP400／rP400>fP535／r P535>fA2／rJ5>fOll／rOl2c>fOI2／r23SI。 3．HLB菌亚洲株系分子鉴定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-SSCP分析及基于 16SrDNA序列中国柑橘黄龙病菌属分类地位的确立，分析结果显示来自中国7省区9个代表性的分离物16SrDNA高度保守，全部属于亚洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)。HLB病菌16S／23SrDNA间区序列分析及系统进化树分析 结果显示：来自中国7省区分布在不同的寄主体内、导致寄主表现不同症状的 18个分离物在该区段没有发生显著变异，各分离物之间的同源性达99％以上， 全部与亚洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)高度同源，而与非洲菌系 (Candidatus Liberobacter africanum)差异较大。 4．HLB病菌Somhem blotting检测。利用α-<'32>p-dCTP标记16SrDNA探针进行HLB 病菌Dot-blotting检测，结果发现Dot-blotting检测灵敏度高于常规PCR而低于 Semi-Nested PCR及Nested-PCR，最低检测下限为30fg总核酸。 5．CTV生物学鉴定、RT-PCR检测技术的建立及来自不同寄主的21个分离物3'端、 5’端分子特性分析。以墨西哥莱檬和甜橙为指示植物，待检样品表现典型的CTV 致病症状。核苷酸序列多重比对分析结果显示：21个CTV分离物的5，端和3' 端共4个变异区(A区，F区，CP，P20)存在明显的差异。A区的核苷酸序列相似性最低，为95.92％；F区的核苷酸序列相似性最高，平均可达98.01％；CP，P20区的核苷酸序列相似性分别为97.20％，96.39％。21个分离物与GenBank中9个代表性的CTV分离物相应区段的核苷酸序列平均相似性分别为84.21％，96.12％，96.25％，95.48％，说明CTV分离物之间在A，F，CP，P20 4个区段核苷酸序列存在较大差异。 　 6．CEVd生物学鉴定及RT-PCR检测技术建立。以Etrog香橼为指示植物，待检样品表现典型的CEVd致病症状。广东、意大利、重庆中柑所分离物全长cDNA克 隆及序列分析结果发现：6个CEVd分离物核苷酸序列相互之间具有明显的差异，同源性介于95.1％-99.2％之间；重庆中柑所分离物ZGS-ZK与意大利分离物Italy-BL核苷酸序列同源性为98.4％，可初步划归为相近的株系；广东分离物XNM-HJ与其它3个分离物核苷酸序列同源性差异在3％左右，因此极有可能为2个不同的株系。 7．CTLV生物学鉴定、RT-PCR检测及3’端扩增克隆及序列分析。以Rusk枳橙作为指示植物，待检样品广东沙糖桔CTLV-GD表现典型的CTLV致病症状。CTLV-GD 3’末端的分子特性分析结果显示：该分离物3'末端核苷酸序列与日本来自百合的分离物D16681、Li-23(AB004063)同源性高达100％；通过对上述分离物以及GenBank中已发表序列的ORF2、V-区以及CP区进行核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较，进一步证实了我国CTLV-GD分离物与日本分离物高度同源；而且与ASGV也具有一定的同源性，特别是ORF2区的氨基酸序列同源性高达93.5％。 8．建立了HLB病菌、CTV、CEVd一步法多重RT-PCR检测体系。敏感性测验证明该体系能够同步检测到10pg总RNA中的HLB和CEVd病原，1pg总RNA中的CTV病毒，说明该体系不失为一种高灵敏度的病原检测方法。 9．HLB病菌、CTV、CEVd超低温脱除技术体系初步建立及脱毒机理初探。通过对影响超低温技术的各个因素的摸索，初步建立了应用超低温技术脱除上述三种病原的方法；结合石蜡切片光学显微镜观察及超薄切片电镜观察，初步探明了超低温技术的脱毒机理，并证明该方法对脱除上述三种病原是有效的：HLB病菌脱除率≥91.6％；CTV脱毒率≥90.O％；CEVd脱除率≥88.8％。

目录

文摘

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第1章文献综述

第2章HLB病菌PCR检测体系建立及亚洲株系(Candidatus Liberobacter asiaticus)分子鉴定

第3章CTV、CEVd、CTLV检测技术建立及分子特性研究

第4章超低温处理脱除HLB病菌、CTV、CEVd的初步研究

参考文献

图版与图版说明

附录

致谢