侵染花生的辣椒褪绿病毒生物学性质及病毒基因组S RNA全序列研究

摘要

病毒病是花生上的重要病害，花生病毒病在我国花生产区均有发生，是影响花生高产稳产的主要限制因素之一。在我国，侵染花生的病毒有花生条纹病毒(PStV)、花生矮化病毒(PSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)。此外，在我国南方的广东、广西花生产区，普遍发生一种番茄斑萎病毒属成员引起的病毒病害，该病毒侵染花生后，最初引起花生叶片出现褪绿黄斑和枯斑，发病叶片逐渐枯死，随后向顶芽发展，引起顶芽枯死，导致整株花生严重矮化，直至死亡；早期感染花生病株颗粒无收。在部分田块，发病率在10％以上，因此该病害将是影响我国(特别是南方)花生生产的潜在因子之一。本研究对该病毒病原进行了系统生物学特性鉴定和病毒基因组S RNA全序列分析，明确该病原为辣椒褪绿病毒(CaCV)的一个新株系，定名为中国花生(CP)株系，这是CaCV在中国发生和侵染花生的首次报道。主要结果如下： 1．2004-2005年调查发现，辣椒褪绿病毒引起的花生病害在广东省广州市郊和东源县部分乡花生产地均有发生，病害发病率在1％左右，部分花生地发病率达5％。发病花生叶片和顶芽坏死、植株矮小、不结荚果，对花生产量造成严重损失。 2．CaCV-CP寄主范围广，在供试的31种植物中，CaCV-CP能系统侵染18种植物，包括花生、菜豆、大豆、豌豆、绿豆、白羽扇豆、决明、田菁、普通烟、黄烟、心叶烟,欧氏烟、白氏烟、番茄、矮牵牛、蔓陀罗、辣椒、瓜豆，产生环状黄斑、枯斑、坏死和花叶等症状。局部侵染6种植物，包括苋色藜、昆诺黎、千日红、豇豆、洋豇豆和望江南，在接种叶上产生褪绿斑、环斑和坏死症状。该病毒不侵染蚕豆、木豆、鹰嘴豆、百日草、黄瓜、芝麻和长春花。 3．CaCV-CP失毒温度为45℃-50℃；稀释限点为10<'-3>-10<'-4>、体外存活时间为5-6 h。病毒粒体为球形，大小80-100 nm，被一层膜包裹。 4.用改进的方法进行提取了CaCV-CP，提纯的CaCV病毒通过免疫新西兰大白兔制备了病毒特异性多克隆抗血清，抗血清效价1:1000(用ELISA方法测定)。间接ELISA实验表明，CaCV-CP与花生芽坏死病毒(GBNV)及西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)抗血清有弱阳性反应，与番茄斑萎病毒(TSWV)抗血清无反应。 5.用纤维素CF-11从发病的欧氏烟叶片中提取CaCV-CP双链RNA，以病毒双链RNA为模板，通过RT-PCR扩增，获得了CaCV-CP基因组S RNA片段全长序列，S RNA全长有3399个核苷酸(nt)。经分析该全长序列包含各66 nt的5’和3，端非编码区(UTR)、1320个nt的非结构蛋白(NSs)基因、828个nt的核衣蛋白(N)基因和1119个nt的Introgenic region(IGR)区域。NSs基因编码一个推测有439个氨基酸的NSs蛋白，分子量为49，854 Da。N基因编码一个推测有275个氨基酸的N蛋白，分子量为30 724 Da。S RNA全序列已登录到GenBank(登录号：DQ355974)。 6.CaCV-CP与已报道的CaCV泰国和澳大利亚株系N基因长度均为828 nt，核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为84.7％～86.4％和92.4～93.1％；与属于同一血清组的WSMoV、GBNV、WBNV和CCSV 4种病毒N基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为63.5％～79.8％和64.6％～82.6％；与Tospovirus其它血清组(型)11种病毒N基因核苷酸序列同源性低于61％，氨基酸序列同源性低于60％。CaCV-CP与泰国CaCV-AIT株系NSs基因长度均为1320 nt，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.4％和88.4％。与同一血清组的WSMoV、GBNV和CCSV 3种病毒NSs基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为61.3％～77.1％和61.6％～82.2％；与Tospovirus其它血清组(型)的8种病毒核苷酸序列同源性低于57％，氨基酸序列同源性低于51％。CaCV株系间及与其它病毒在2个ORFs连接区(Intergenic Region，IGR)的序列同源性最低、变异最大。

目录

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

1花生的经济重要性

2花生病毒

2.1侵染花生的病毒种类

2.2我国花生病毒种类及病害发生情况

3我国花生上几种重要病毒的研究进展

3.1花生条纹病毒

3.2花生矮化病毒

3.3黄瓜花叶病毒

4番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒

5选题依据及研究目的、意义

第二章侵染花生的辣椒褪绿病毒研究

1引言

2试验材料

2.1病毒

2.1试剂

3试验方法

3.1广东省花生芽枯病毒病害发生及分布调查

3.2病毒寄主范围测定

3.3病毒体外稳定性检测定

3.4病毒粒体形态观察

3.5病毒提纯

3.6病毒抗血清制备及血清学关系研究

3.7病毒双链RNA提取

3.8引物设计及合成

3.9病毒S RNA cDNA合成

3.10 cDNA序列测定

3.11DNA序列的计算机分析

3.12 CaCV-CP分子检测技术

3结果和分析

3.1 CaCV-CP引起的花生病害症状

3.2广东省花生上CaCV-CP发生及分布调查

3.3 CaCV-CP寄主范围

3.4 CaCV-CP体外稳定性

3.5 CaCV-CP提纯及病毒粒体形态

3.6 CaCV-CP抗血清及血清学关系

3.7 CaCV-CP双链RNA提取

3.8 CaCV-CP S RNA序列及结构

3.9 CaCV-CP与CaCV其它株系及TOSPOVIRUS属病毒S RNA序列长度比较

3.10 CaCV与CACV其它株系及Tospovirus属病毒序列同源性比较

3.11 CaCV-CP分子检测技术

4讨论

4.1 CaCV的分布及起源

4.2 CaCV侵染寄主及传播介体

4.3 CaCV提纯

4.4 CaCV-CP血清和分子检测技术

4.5 Tospovirus小片段(S)RNA的序列变异

4.6 CaCV-CP分类地位

结论

参考文献

图版与说明

附录

致谢