新型联合修饰的RNA寡核苷酸在肌肉萎缩疾病治疗中的应用和研究

摘要

FOXO1是FOXO forkhead转录调控因子家族的一个成员，它在肌细胞的分化、代谢和增殖中都起到了重要的作用，能够显著的调节肌肉生长，尤其是在能量消耗性疾病中起到重要的作用，例如消耗性糖尿病。 本课题拟将直接化学合成的模拟microRNA的小RNA分子(19-23nt)进行2’-O-甲基化和3’末端丁醇基多位点联合修饰，以期增强小RNA对靶序列的亲和力和对核酸内切酶及3’-外切酶的抗性，探索小RNA分子在肌肉萎缩疾病中的治疗作用。以FOXO1基因作为抑制的靶位点，在细胞水平、正常小鼠模型、相关疾病小鼠模型中选择能有效抑制FOXO1表达的小RNA分子，找到并确定能够进行临床实验的有效地抑制FOXO1基因的小RNA分子，为其临床治疗肌肉萎缩疾病提供理论基础。 本研究利用新型修饰的寡核苷酸RNA的进行体内体外实验结果表明，它能够特异性的与目标基因FOXO1结合，显著抑制FOXO1基因的表达。主要表现在利用新策略修饰的寡核苷酸RNA在细胞水平、正常小鼠水平以及疾病小鼠模型水平上都能够降低FOXO1基因的表达。另外，Western Blotting和Real-Time PCR的结果表明，肌肉生长抑制素GDF-8基因和肌肉生长决定因子MyoD的表达量发生变化。 首先将一些新型修饰的RNA寡核苷酸转染肌成纤维细胞C2C12，筛选得到有效的RNA寡核苷酸后，直接注射700μg的RNA寡核苷酸于正常小鼠模型和疾病小鼠模型S-180，结果显示这些新合成的靶向FOXO1的基因能够被有效的抑制，更为有趣的是，FOXO1的基因被抑制后直接导致了骨骼肌生长的有效增加。这个结果进一步的显示，FOXO1是肌肉生长的负调控因子。 另外，进一步实验结果的显示，抑制螺旋结构的FOXO1的表达增加肌肉质量的同时，GDF-8基因和MyoD基因在mRNA水平和蛋白质水平上的表达都受到了显著的影响：其中GDF-8基因的表达得到了显著抑制，而MyoD的表达得到了相应得增加。将结果结合起来综合分析，可以得知，FOXO1是引起肌肉生长消耗和一些恶病子的关键原因。因此这个实验在病理上给了一个新的途径治疗肌肉萎缩疾病。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

1前言

1.1肌肉生长失调的相关疾病

1.2关于FOXO1的研究进展

1.2.1 FoxO基因的结构特点

1.2.2 FOXO1磷酸化与肌源细胞核管融合的关系

1.2.3 FoxO对靶基因的调节作用

1.2.4 FOXO蛋白的修饰与细胞凋亡和癌变

1.3 FOXO1与胰岛素样生长因子(IGF-1)共同调控肌肉生长

1.4 MYOD的研究进展

1.4.1 MyoD概述

1.4.2成肌调节因子MRFs家族成员之间的关系

1.4.3 MyoD的研究意义

1.5 GDF-8的研究进展

1.5.1 GDF-8的分子生物学性质

1.5.2 GDF-8和肌肉生长失衡

1.5.3 GDF-8的研究意义

1.6 FOXO1与MYOSTATIN及MYOD的相关性

1.6.1 FOXO1(FKHR)与GDF-8的相关性

1.6.2FOXO1(FKHR)与MyoD的相关性

1.7 RNA干扰技术

1.7.1 siRNA分子的设计

1.7.2 siRNA分子的制备

1.7.3转染细胞和个体的方法

1.7.4分析RNAi的效果

1.8本工作的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 RNA oligos

2.1.2细胞系

2.1.3主要试剂及试剂盒

2.1.4其它主要试剂

2.1.5 PCR引物序列

2.1.6主要仪器

2.2实验动物、方法及技术路线

2.2.1实验动物和注射方法

2.2.2技术路线

2.3试验方法

2.3.1细胞培养

2.3.2转染的流程

2.3.3动物水平的试验

2.3.4 Western blotting检测蛋白的表达水平

2.2.3荧光定量PCR(Real-Time PCR)

2.4统计学分析

3结果与分析

3.1 RNA寡核苷酸GRR-7对C2C12细胞系FOXO1基因表达的影响

3.2 RNA寡核苷酸GRR-7对C2C12细胞系GDF-8基因表达的影响

3.3 RNA寡核苷酸GRR-7对C2C12细胞系MYOD基因表达的影响

3.4 RNA寡核苷酸GRR-7对正常小鼠FOXO1基因表达的影响

3.5抑制正常小鼠FOXO1基因表达对GDF-8基因表达的影响

3.6抑制正常小鼠FOXO1基因表达对MYOD基因表达的影响

3.7抑制正常小鼠FOXO1基因表达对正常小鼠肌肉生长的影响

3.8建立S-180疾病小鼠模型

3.9 RNA寡核苷酸GRR-7对疾病小鼠模型S-180的FOXO1基因表达的影响

3.10抑制疾病小鼠模型S-180的FOXO1基因表达对GDF-8基因的影响

3.11抑制疾病小鼠模型S-180的FOXO1基因表达对MYOD基因的影响

3.12疾病小鼠模型S-180的FOXO1基因表达抑制对小鼠肌肉生长的影响

4讨论

参考文献

致谢