二化螟诱导水稻表达的基因及二化螟特异诱导水稻启动子的克隆

摘要

二化螟(Chilosuppressalis)是一种为害严重的世界性水稻害虫，目前还未见水稻对二化螟防御反应分子机制、水稻被二化螟取食特异诱导表达启动子研究的报道。本研究的目的在于：将扣除杂交技术和cDNA点阵技术相结合，得到水稻被二化螟诱导表达的基因，推测水稻对二化螟防御反应分子机制，克隆并鉴定水稻被二化螟特异诱导表达的启动子。 将水稻被二化螟取食后叶鞘mRNA及对照mRNA分别作为tester和driver构建cDNA扣除文库，文库I以二化螟取食后叶鞘mRNA为tester，以对照mRNA为driver，文库Ⅱ刚好相反。理论上，来自于文库I的EST为二化螟诱导上升表达的基因，来自于文库II的EST为二化螟诱导下降表达的基因。从两个文库中共挑取864个克隆测序，序列拚接后得到271条unisequence。通过BIASTN和BLASTX分析这些序列的功能，结果表明这些基因涉及到光合作用、基础代谢、次生代谢、信号传导、蛋白降解、电子传递等多个代谢途径，这说明水稻对二化螟的防御反应是一个全基因组水平转录调整过程。 将这271个cDNA克隆、来自于本室明恢63全生育期平衡化cDNA文库的113个克隆、阳性对照及阴性对照cDNA克隆抽提质粒点在尼龙膜上，将二化螟取食后6h明恢63叶鞘及对照叶鞘总RNA反转录并用：32p标记成探针与尼龙膜杂交，杂交重复2次。结果得到在两次杂交中皆上升表达的基因12个，在两次杂交中皆下降表达的基因5个。尼龙膜杂交得到的差异表达克隆大大少于扣除杂交得到的差异表达克隆，但在这17个差异表达的克隆中，上升表达的基因基本上来自于文库I(1个例外)，下降表达的基因基本上来自于文库II(1个例外)，这说明扣除杂交技术与cDNA点阵技术之间的主要差异在于两者的灵敏度不同。 为了得到二化螟特异诱导表达的水稻启动子，从以上17个差异表达克隆中随机挑取4个上升表达克隆进行Northernblot分析。其中3个克隆同时被机械损伤和二化螟取食诱导。1个可能编码胰凝乳蛋白酶抑制剂的克隆-B1-A04在二化螟取食后急剧上升表达，但是机械损伤处理时其表达量几乎与对照一样，没有明显的变化。 通过PCR从基因组中克隆了B1-A04基因的启动子片段，如果将转录起始位点定位为1，则该启动子片段覆盖了-1569至＋446之间的区域，包括B1-A04基因部分编码序列。将该片段(为了描述方便，命名为-1569)与GUS报告基因融合并通过农杆菌转化到水稻品种中花11中。在转基因植株中，二化螟未取食时，GUS基因在茎杆与幼穗中表达，在叶片与叶鞘中不表达；二化螟取食6h后，GUS基因在叶鞘与茎杆中的表达活性明显上升，但是叶片中仍然不表达。这说明该启动子具有器官特异表达、发育阶段特异表达的特点。GUS基因及内源B1-A04基因的表达水平在外源茉莉酸、脱落酸处理前后没有明显的变化。 为了了解-1569片段可能的调控区域，本研究从-1569的5’-end进行缺失，得到-1166至＋446(命名为-1166)、-582至＋446(命名为-582)、-371至＋446(命名为-371)、-112至＋446(命名为-112)4个截短的启动子片段。通过GUS活性测定及GUS组织染色可知在-1569位点至-1166位点、-1166位点至-582位点之间存在负调控顺式因子，在未被二化螟取食时抑制GUS基因在叶鞘中表达，被二化螟取食后开放。凝胶阻滞试验(EMSA)鉴定出7个与对照叶鞘核蛋白、二化螟取食后叶鞘核蛋白、机械损伤叶鞘核蛋白结合能力有差异的DNA探针，本文对这7段DNA对下游基因的可能调控作用进行了讨论。 本研究中得到的-1569启动子片段在水稻转基因育种中具有应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1前言

1.1植物对昆虫的防御反应

1.1.1直接防御反应

1.1.2间接防御反应

1.1.3耐受反应

1.1.4植物防御反应的代价

1.2引起植物识别昆虫并作出特异反应的激活子(elicitor)

1.3在植物对昆虫的防御反应中植物激素的作用

1.3.1 JA及其衍生物

1.3.2 SA及其衍生物

1.3.3乙烯

1.3.4ABA

1.3.5 JA与SA之间的互作

1.4植物对昆虫的防御反应分子机制研究进展

1.4.1传统的研究基因表达的手段

1.4.2生物芯片(DNA microarray)技术

1.4.3高密度cDNA点阵技术(DNA macroarray)

1.4.4植物被昆虫取食后的基因表达特点

1.4.5水稻、野生稻被昆虫诱导表达基因的研究进展

1.5植物蛋白酶抑制剂研究进展

1.5.1植物蛋白酶抑制剂和昆虫蛋白酶的相互作用

1.5.2植物蛋白酶抑制剂的种类

1.5.3水稻蛋白酶抑制剂的研究概况

1.6植物被昆虫诱导表达启动子的研究进展

1.6.1真核生物启动子的基本结构

1.6.2诱导表达的启动子

1.6.3昆虫诱导启动子的研究概况

1.7本研究中涉及到的启动子结构和功能研究方法

1.7.1启动子的预测工具

1.7.2启动子强弱和功能的定性、定量检测

1.7.3凝胶阻滞实验(EMSA)

2研究的目的与意义

2.1得到水稻被二化螟诱导表达的基因

2.2二化螟特异诱导启动子的克隆与调控区域研究

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1水稻品种

3.1.2基因组文库膜及平衡化cDNA文库

3.1.3载体、菌株和质粒

3.1.4供试昆虫

3.2实验方法

3.2.1 DNA的抽提及Southern杂交

3.2.2总RNA抽提及Northern blot

3.2.3明恢63二化螟取食处理与机械损伤处理

3.2.4水稻二化螟诱导扣除文库的构建

3.2.5扣除文库克隆测序、序列拼接及EST的功能分析

3.2.6 cDNA点阵膜的制备

3.2.7 cDNA点阵杂交

3.2.8启动子候选片段及顺式作用因子的预测

3.2.9不同长度启动子片段的获得

3.2.10水稻的遗传转化

3.2.11 GUS的组织化学染色及GUS的定量分析

3.2.12转基因植株GUS基因表达Northern blot分析

3.2.13激素处理

3.2.14凝胶阻滞实验

4结果与分析

4.1扣除文库概况

4.1.1构建文库的RNA质量检测

4.1.2文库的扣除效果检测

4.1.3扣除文库插入片段大小检测

4.2扣除文库cDNA序列的数量及大小

4.3扣除文库中的基因冗余度

4.4扣除文库中unisequence的功能分析

4.5 CDNA点阵杂交结果

4.5.1上升表达基因

4.5.2下降表达基因

4.6部分上升表达克隆在机械损伤和二化螟取食下时间表达谱

4.7 B1-A04在基因组中的拷贝数及染色体定位

4.8 B1-A04基因在水稻分蘖期和孕穗期不同器官表达情况

4.9 -1569：：GUS转基因植株的GUS基因和内源B1-A04基因对JA和ABA的反应

4.9.1 Northern blot分析

4.9.2 GUS活性变化

4.10不同启动子片段驱动下的GUS基因组成型表达量

4.11不同启动子片段驱动下的GUS在二化螟取食后的表达量

4.12凝胶阻滞试验

5讨论

5.1关于二化螟接虫试验的一点体会

5.2扣除杂交技术是发现植物新基因的经济有效的手段

5.3扣除杂交技术与DNA macroarray技术相结合的优点

5.4 cDNA点阵杂交得到的差异表达克隆少于扣除杂交的原因

5.5二化螟取食后水稻基因表达特点

5.6本研究与Yuan等的研究比较

5.6.1相同之处

5.6.2不同之处

5.7机械损伤和二化螟取食后水稻基因表达特点不同

5.8-1569启动子片段的调控区域

5.9调控区域可能与-1569启动子表达模式有关的模体预测

5.10 B1-A04的表达特点

5.11激素对B1-A04的调控作用

5.12本研究试验设计的不足之处

5.13本研究得到的启动子有待于进一步研究的内容

5.14-1569启动子片段的应用前景

参考文献

附录1：部分试验的详细步骤

附录2：个人简历

致谢