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第一章 文献综述
1.1马铃薯概述
1.2马铃薯块茎低温糖化机理及抗低温糖化基因工程改良
1.2.1植物细胞低温糖化的普遍性
1.2.2马铃薯块茎低温糖化的生物化学机制
1.2.3马铃薯抗低温糖化育种可能的突破点
1.3低温胁迫与植物低温抗性研究进展
1.3.1低温胁迫下植物细胞生理的变化
1.3.2植物细胞应对低温胁迫的渗透调节
1.3.3低温诱导表达基因研究
1.4植物启动子研究
1.4.1植物启动子的基本结构及其功能
1.4.2启动子的类型
1.4.3真核生物融合启动子研究进展
1.5本研究的目的、意义和主要内容
第二章 材料与方法
2.1实验材料
2.1.1植物材料
2.1.2菌种和质粒
2.2实验方法
2.2.1质粒的小量提取
2.2.2大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
2.2.3农杆菌感受态的制备及转化
2.2.4农杆菌介导的植物遗传转化
2.2.5植物基因组DNA的提取
2.2.6马铃薯叶片RNA的提取
2.2.7 cDNA第一链的合成
2.2.8转基因植株的Southern杂交
2.2.9 GUS活性测定
2.2.10 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.2.11凝胶电泳迁移率实验(EMSA)
第三章 cor15a基因启动子与ci21A基因启动子低温诱导活性的比较研究
3.1前言
3.2材料与方法
3.2.1植物材料
3.2.2菌种和质粒
3.2.3酶和试剂
3.2.4常规DNA操作
3.2.5 cor15a基因启动子片段的PCR扩增
3.2.6 ci21A基因启动子的PCR扩增
3.2.7表达载体pLB和pCI21A的构建
3.2.8烟草的遗传转化及植株再生
3.2.9烟草转化植株的PCR检测和Southern杂交鉴定
3.2.10转基因烟草的低温处理和GUS组织化学染色
3.2.11 GUS活性的荧光定量测定
3.3结果与分析
3.3.1 cor15a基因启动子的PCR扩增及启动子序列
3.3.2 ci21A基因启动子的PCR扩增及启动子序列
3.3.3遗传转化载体pLB的构建
3.3.4遗传转化载体pCI21A的构建
3.3.5转基因烟草植株的获得
3.3.6转基因烟草植株的PCR和Southern杂交鉴定
3.3.7 cor15a与ci21A基因启动子在烟草中的表达特点
3.3.8 cor15a与ci21A基因启动子在烟草中的低温诱导活性
3.4讨论
第四章 拟南芥低温诱导cor15a基因启动子在马铃薯中的功能
4.1前言
4.2材料与方法
4.2.1植物材料
4.2.2菌种和质粒
4.2.3马铃薯的遗传转化及植株再生
4.2.4马铃薯转化植株的PCR和Southern杂交鉴定
4.2.5转基因马铃薯的低温处理及GUS组织化学染色
4.2.6 GUS荧光定量测定
4.3结果与分析
4.3.1马铃薯转化植株的获得
4.3.2转基因植株的PCR和Southern杂交鉴定
4.3.3 cor15a基因启动子在转基因马铃薯叶片中的低温诱导表达
4.3.4 cor15a基因启动子在转基因马铃薯不同组织中的GUS活性检测
4.4讨论
第五章 低温诱导的块茎特异融合启动子的构建及在马铃薯中的功能
5.1前言
5.2材料与方法
5.2.1植物材料、菌株和培养基
5.2.2融合启动子pCL和pLC的构建
5.2.3马铃薯转化载体的构建
5.2.4马铃薯的遗传转化
5.2.5转基因植株的PCR筛选和Southern杂交分析
5.2.6转基因马铃薯的低温处理和GUS酶活性荧光分析
5.3结果与分析
5.3.1融合启动子pCL和pLC的构建
5.3.2马铃薯转化载体的构建
5.3.3马铃薯的遗传转化及转化植株的获得
5.3.4转化植株的PCR筛选和Southern杂交鉴定
5.3.5融合启动子在马铃薯中的表达活性和低温诱导性
5.4讨论
第六章 马铃薯CBF/DREB类转录因子基因的克隆、原核表达及其与LTRE的结合功能研究
6.1前言
6.2材料与方法
6.2.1植物材料与低温处理
6.2.2菌种和质粒
6.2.3马铃薯叶片总RNA的抽提及cDNA第一链的合成
6.2.4马铃薯CBF/DREB基因蛋白质编码区的PCR扩增
6.2.5 蛋白质编码区的序列分析及同源基因的比较
6.2.6 GST融合蛋白表达载体的构建
6.2.7 融合蛋白的诱导表达及检测
6.2.8可溶性GST融合蛋白的提取和纯化
6.2.9融合蛋白与启动子调控序列之间的互作研究
6.2.10 CBF/DREB基因的拷贝数分析
6.2.11 CBF/DREB基因表达模式分析
6.3结果与分析
6.3.1马铃薯CBF/DREB基因的PCR扩增
6.3.2基因的序列分析
6.3.3 GST融合蛋白表达载体的构建
6.3.4 GST融合蛋白的表达
6.3.5可溶性GST融合蛋白的提取和纯化
6.3.6 GST融合蛋白的结合功能分析
6.3.7 St-CBF在E3和CW2-1基因组中的拷贝数分析
6.3.8 St-CBF基因在E3和CW2-1中表达模式的分析
6.3讨论
第七章 讨论
7.1启动子选择与马铃薯基因工程
7.2融合启动子研究
7.3 CBF/DREB类转录因子与马铃薯基因工程改良
7.4后续研究展望
7.4.1低温诱导和块茎特异表达融合启动子的构建研究
7.4.2 St-CBF基因的研究
参考文献
附录
致谢