黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究

摘要

内切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)是一种重要的工业用酶，广泛应用于饲料工业，酿造业等领域。随着生产的发展，β-1，4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是，从分泌热稳定性的β-1，4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中，克隆该基因，利用基因工程手段实现高效表达，满足工业生产的需求。 实验首先是利用RT-PCR技术，提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录，并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1，4-葡聚糖酶基因egI，将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上，使之位于α-因子信号肽下游，并与之同框，构建重组表达质粒pPIC9k-egI，电击转化毕赤酵母GS115，经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选，得到重组毕赤酵母工程菌1-1＃和1-5＃，在摇瓶发酵水平上，以0.5％的β-葡聚糖为底物检测，酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适pH为5.0，最适反应温度为70℃，在70℃时保温30min后仍然具有90％以上的活力。 为了进一步提高表达量，根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于AnigerL3的内切β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列，共改变193个碱基，G+C％由54％下降到44.22％。设计了14对寡聚核苷酸引物，采用重叠延伸PCR三步法获得全长基因序列共改变。将其插入到毕赤酵母表达载体。pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC9k-syn-egI，电击转化毕赤酵母GS115，经MM、MD、CMC-Na和G418平板以及摇瓶筛选，得到重组毕赤酵母工程菌2－7＃。摇瓶发酵条件下，以0.5％的葡聚糖和1％的CMC-Na为底物检测，酶活分别达到3658U/mL和591.9U/mL；采用50L发酵罐进行发酵，酶活则分别达到65649.6U/mL和39728.32U/mL。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引 言

1.1β-葡聚糖概述

1.2纤维素概述

1.3β-1，4-葡聚糖酶

1.3.1性质与分布

1.3.2结构特征

1.3.3基因工程研究

1.3.4应用

1.4毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统

1.4.1表达载体

1.4.2宿主菌株

1.4.3优化表达的策略

1.4.4发酵条件优化

1.5研究目的：

第二章黑曲霉来源的内切β-1，4-葡聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2工具酶

2.1.3试剂

2.1.4培养基和部分溶液的配制

2.1.5主要仪器

2.2方法

2.2.1黑曲霉中菌丝RNA的提取

2.2.2反转录

2.2.3葡聚糖酶基因的克隆

2.2.4序列测定

2.2.5酵母重组表达载体的构建

2.2.6重组质粒的抽提和验证

2.2.7重组酵母的构建

2.2.8重组酵母的筛选

2.2.9重组酵母的产酶发酵

2.2.10酶活检测

2.2.11 SDS-PAGE电泳

2.2.12重组酶的酶学性质

2.3结果与分析

2.3.1葡聚糖酶基因的克隆

2.3.2葡聚糖酶基因序列的测定

2.3.3表达质粒的构建及验证

2.3.4重组酵母的筛选

2.3.5重组酵母工程菌的产酶发酵

2.3.6重组酶的酶学性质

2.4讨论

第三章内切β-1，4-葡聚糖酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达

3.1材料

3.1.1菌株与质粒

3.1.2工具酶

3.1.3试剂

3.1.4培养基和部分溶液的配制

3.1.5主要仪器

3.2方法

3.2.1内切β-1，4-葡聚糖酶基因(egⅠ)密码子优化

3.2.2密码子优化的内切β-1，4-葡聚糖酶基因的合成

3.2.3重组表达载体的构建

3.2.4重组表达载体pPIC9K-syn-eg Ⅰ的抽提和验证

3.2.5重组酵母的构建

3.2.6重组酵母的筛选

3.2.7重组酵母的筛选

3.2.9重组酵母发酵罐水平高密度发酵

3.3结果与分析

3.3.1密码子优化的内切β-1，4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的合成

3.3.2密码子优化的内切β-1，4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的序列测定

3.3.3重组表达载体的验证

3.3.4重组酵母的筛选

3.3.5发酵条件的优化

3.3.6发酵罐水平的高密度发酵

3.3讨论

3.3.1密码子优化

3.3.2基因合成技术

3.3.3发酵条件的优化

4.小结

参考文献

致谢

附录