水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析

摘要

水稻是重要的粮食作物之一，如何更加有效的提高水稻产量是全世界都关注的重要问题之一。水稻籼粳亚种间的杂种优势很早就被发现，但是籼、粳杂种F1普遍存在不育或者半不育的现象，这使得籼粳亚种间杂种优势的利用受到了极大的限制。幸好，水稻资源中存在着一类特殊的种质资源，即广亲和品种。它能有效克服籼、粳亚种不育或者半不育现象，给籼、粳杂种利用带来希望。
　　 本研究主要是分离克隆控制籼粳广亲和性状的一个主效基因S5基因，该基因位于水稻第6染色体上，编码一个天冬氨酸蛋白酶，通过控制籼粳杂种F1代雌配子的育性而影响结实率。本研究在前人对S5位点定位工作基础上展开研究，S5定位区段内主要包含三个候选基因为ORF3、ORF4和ORF5。对ORF3、ORF4和ORF5分别构建包含籼稻片段的正义转化载体，以粳稻Balilla为转化受体进行转化。通过对转基因植株小穗育性的考察，发现ORF3和ORF4的T0代转基因阳性植株和阴性植株的结实率不存在显著的差异，因此排除ORF3和ORF4作为候选基因的可能性。分析ORF5的T0代转基因植株育性数据，发现转基因阳性植株的平均结实率2.8％，胚囊育性为12.8％，而阴性植株的平均结实率是53.3％，胚囊育性是76.7％，两者的花粉育性都在80％以上。以上结果表明，转基因阳性植株结实率下降的原因主要是胚囊败育，这表明ORF5可能是S5基因。进一步分析ORF5的T1代转基因植株育性数据，发现ORF5 T1（B10）代正义转化阳性植株平均胚囊育性为1.3％，阴性植株平均胚囊育性为92.3％；阳性植株平均花粉育性为90.4％，阴性植株平均花粉育性为87.9％；阳性植株平均结实率为0，阴性植株平均结实率为89.4％，这一结果是完全共分离的，因此确定ORF5就是S5基因。为了分析S5基因在广亲和品种中的功能，采用将正义转化载体ORF5-NJ11转入受体广亲和品种02428后，得到的T1代转基因阳性植株分别同籼稻南京11和粳稻Balilia测交，考察测交后植株的结实率和胚囊育性，其中转基因阳性株系C04T1与粳稻Balilla进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是53.6％和53.5％，转基因阴性株系C04T1与粳稻Balilla进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是81.9％和72.8％；转基因阳性株系C04T1与籼稻南京11进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别85％和67.5％，转基因阴性株系C04T1与籼稻南京11进行测交后植株的胚囊育性和小穗育性分别是85％和63.5％。而另一株系C02T1测交后的胚囊育性类似于C04的结果。这一结果说明S5-n是没有功能的。通过原位杂交分析S5基因的表达情况，发现该基因主要在珠心细胞、珠被、孢原细胞、大孢子母细胞中表达，在叶片、根等营养器官中没有表达。
　　 本研究还对S5基因编码的天冬氨酸蛋白酶家族在水稻中的分布情况、进化关系、基因与蛋白的结构及天冬氨酸蛋白酶家族在水稻中在水稻中的表达情况进行了详细的分析。通过BLASTp搜索方法在TIGR、KOME、NCBI RefSeq数据库中进行搜索，最终确定水稻基因组中共有96个OsAP基因，它们分布在水稻12条染色体的不同位置。在进化上96个OsAP蛋白分可分为A、B和C三大类型，其中A类基因相比其他两类在进化上更加保守。而C类基因在数量上最多，在基因结构上变异最大。根据CREP数据库中明恢63和珍汕97表达谱芯片数据，分析水稻中OsAP基因家族表达情况。通过聚类分析66个表达的OsAP基因，可以分为三类。第Ⅰ类有分为4个亚类，Ⅰα和Ⅰγ亚类基因表达量都很低，Ⅰβ亚类的特点是在根中的表达相比其他组织表达要高，而Ⅰδ亚类主要是在开花前一天的雄蕊中高表达。第Ⅱ类包含26个基因，该类特点主要在营养组织表达量相对较高，而在幼穗组织中表达量相对较低；第Ⅲ类包含17个基因，该类特点是基因在大部分营养器官表达量比较低，但在幼穗发育时期的表达量比较高。同时，本研究也对OsAP家族在光暗处理及激素处理情况下的差异表达基因也进行了分析，发现对珍汕97和明恢63发芽后48小时的胚芽及胚根进行连续光照处理48小时和连续暗处理48小时处理后共有14个2倍差异表达OsAP基因。在激素（NAA，GA3和KT）处理的条件下的表达情况相比3叶期的苗叶（seedling），共有9个2倍差异表达OsAP基因。另外，比较分析12对位于大片段复制区的重复基因的表达模式，有7对在进化中出现新功能化，说明这个家族在进化中出现新功能化是在一个相对较高的水平。

目录

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论文说明：缩略词表

声明

1.文献综述

1.1水稻籼粳杂种不育机理的研究

1.1.1籼粳亚种间的遗传分化

1.1.2籼粳杂种不育的遗传模型

1.1.3籼粳杂种不育的细胞学研究

1.1.4水稻籼粳杂种不育基因的定位

1.1.5水稻S5基因的定位

1.2被子植物雌配子体的发育

1.2.1胚囊发育

1.2.2胚囊的整个发育过程的基因调控

1.2.3花粉管的引导

1.2.4受精和助细胞的死亡

1.3天冬氨酸蛋白酶家族

1.3.1 A1家族天冬氨酸酶蛋白酶的结构和特性

1.3.2天冬氨酸蛋白酶中的PSI序列的特点

1.3.3植物天冬氨酸酶蛋白酶的功能

1.3.4天冬氨酸酶蛋白酶在水稻和拟南芥中的研究进展

1.4本研究目的与意义

2.材料与方法

2.1水稻材料

2.2转化载体及菌株

2.3遗传转化载体构建及转化

2.3.1正义转化载体构建

2.3.2 ORF5正义转化载体构建

2.3.3 ORF5超表达载体构建

2.3.4 RNAi抑制载体构建及阳性检测

2.3.5启动子载体构建

2.3.6原位表达探针载体构建

2.3.7拟南芥转化载体构建

2.3.8农杆菌介导的遗传转化

2.4转基因植株的DNA抽提,阳性检测及Southern杂交

2.5组织切片

2.6原位杂交

2.7不同基因型单株的育性考察

2.8数据库搜索

2.9基因染色体分布与基因组倍增

2.10进化树分析

2.11基因结构和蛋白结构的分析

2.12水稻材料及其处理情况

2.13表达谱分析

3结果与分析

3.1侯选基因的初步定位

3.2遗传转化的策略

3.3 ORF3正义转化遗传分析

3.4 ORF3启动子分析

3.5 ORF4正义转化遗传分析

3.6 ORF5正义转化遗传分析

3.6.1 ORF5 T0代植株正义转化遗传分析

3.6.2 ORF5 T1代转基因植株的阳性检测及转基因植物的育性考察

3.7广亲和等位基因分析

3.7.1 02428 S5位点的基因组序列分析

3.7.2 02428 S5-n位点的遗传转化及杂交策略

3.7.3转基因植株的阳性检测和育性考察

3.8超表达载体及RNAi抑制载体的转化及表型分析

3.8.1超表达载体转化后的表型分析

3.8.2 RNAi抑制载体的转化阳性检测与表达量分析

3.9 S5基因表达模式

3.10 AP家族在水稻中的数量

3.11基因的染色体分布与基因组倍增

3.12水稻和拟南芥AP家族进化分析

3.13 OsAP蛋白和基因的结构

3.14 OsAP基因表达谱分析

3.15 OsAP基因在光暗和激素处理下的表达情况

3.16重复基因表达模式的分析

4.讨论

4.1水稻籼粳亚种间的偏分离现象

4.2 S5基因编码的天冬氨酸蛋白酶在籼粳和广亲和之间的差异

4.3 3等位基因互作与育性的关系

4.4广亲和标记的利用

4.5水稻OsAP基因的表达与功能

5.总结与展望

参考文献

附录

致谢

作者简介、硕博连读期间发表论文、会议论文摘要及专利申请