Genetic Diversity and Population Structure of Chinese Misgurnus Anguillicaudatus and Elopichthys Bambusa in the Yangtze River Basin as Revealed by Molecular Markers

摘要

长江自西向东流经青海、云南、湖北、上海等11个省市自治区，横跨西南、华中、华东三大经济区，是中国流域范围最广的河流，也是世界第三长的河流。历史上长江流域河网密布，形成了复杂的江湖复合生态系统，并由此孕育了丰富的鱼类物种资源。半个世纪以来，随着中国经济的发展和城市化进程的加速，长江流域不断修建大坝，灌渠等水利设施，对河流生态系统中的鱼类群落造成了巨大影响。这些人为活动对鱼类生物多样性的影响需要通过不同尺度的研究来评估其危害性。本论文的主要内容是使用微卫星标记研究长江流域泥鳅（Misgurnusanguillicaudatus）和鳡（Elopichthys bambusa）的遗传多样性，同时结合线粒体细胞色素b基因研究了鳃的系统发育和遗传结构。
　　 泥鳅是一种广泛分布于东亚浅水环境的小型淡水鱼类，具有重要的经济价值。几十年来，其自然栖息地的主要水文环境已经发生改变，而泥鳅自然种群的遗传结构却至今未能揭示。本实验室共采集了来自长江中下游以及汉江水系的12个群体的泥鳅样本，使用13个具有多态性的微卫星标记对所有样本进行基因组扫描。每个位点的等位基因数在2到8个之间，平均每个位点有4.6个等位基因。观测杂合度最低为0.38，最高为0.95。所有位点的观测杂合度和期望杂合度分别为0.57和0.56。所有的微卫星位点中，大约50％显著偏离（P<0.01）哈代-温伯格平衡，显示出明显的杂合缺失。杂合缺失可能是由于过度捕捞和迁移不平衡造成的。分子方差分析（AMOVA）显示，大多数的变异存在于个体间（90.50％），而群体间变异则较少（9.03％）。通过计算固定系数（FST）和标准遗传距离，发现采集于分离栖息地的泥鳅，其遗传距离相较于长江水系的群体，遗传差异显著，遗传距离较远。UPGMA聚类分析将所有的泥鳅群体聚为两大类，其中令人惊异的是，ZIG和XGN群体在遗传学上的聚类位置与其地理聚类位置刚好相反。概括地说，本研究的主要发现是华中地区的泥鳅群体主要聚类为两大地理种群，而此两大种群的分化则一般归结为调查采样的局限，泥鳅活动能力的低下以及长江近年来泛滥的减少，这些都是导致泥鳅群体之间基因交流减少的可能原因。
　　 鳡是本研究涉及的另外一种鱼。尽管长江流域鱼类资源丰富，但是到目前为止，鳡属到目前只报道了鳡一个种。由于人为和环境因素的干扰，长江流域中鳡的资源总量正在持续减少，由于长期以来缺少对鳡的遗传和生态习性的系统而详细的资料，对鳡资源状况的评估和保护都存在着很大的不足。本研究利用微卫星标记和线粒体细胞色素b基因评估了鳡的遗传多样性和遗传结构，并构建了鳡的系统发育树。使用9个多态性的微卫星标记，扫描了长江中下游的5个鳡群体，发现所有群体间只存在低度到中度的遗传分化。每个微卫星位点的等位基因数在3到8个之间，平均每个位点4.8个等位基因。观测杂合度的范围在0.15到1.0之间，所有位点的平均观测杂合度和期望杂合度分别是0.65到0.70。对所有群体整合分析，发现显著偏离（P<0.01）哈代-温伯格平衡，显示出明显的杂合缺失。分子方差分析（AMOVA）显示，大多数的变异存在于个体间（93.81％），而群体间变异则较少（7.05％）。固定系数（FST）和标准遗传距离计算发现长江水系的不同支流之间的遗传距离明显较大。UPGMA聚类分析显示，不同群体之间的遗传聚类与其地理距离显著正相关。同样利用这5个地理群体进行了细胞色素b基因的序列分析。五个群体共73个个体的细胞色素b基因得到测序，总共产生了3个线粒体DNA聚类，表现出高度的核苷酸和单倍体型多样性。73个个体共产生39个单倍型，单倍型多样性在0.8727到0.9777之间。NJ树和分子方差分析揭示出一个存在于不同聚类间的基因流。PYL、DTL和WHN群体聚为一类，而THL，和DJR群体则各自单独聚为一类。微卫星实验的结果和细胞色素b的实验结果互为佐证，证实了各自结论的正确性。上个世纪长江流域发生的水文学变化，可能导致了鳡的进化，而我们研究的结果则显示，以前被定为一个种的鳡，通过线粒体DNA研究，可能可以归为三个不同的种。
　　 本研究探讨了泥鳅和鳡遗传分化涉及的主要因素，并且描述了华中地区这两种鱼的不同地理种群的现有的遗传结构，为人们进一步研究这它们的保护策略和管理方案奠定了基础。这两个种群自然群体的减少暗示我们必须加大对其的保护力度，以维持必要的遗传多样性。人为活动导致栖息地的分割和水文环境改变，在遗传上导致近交强度加大而遗传多样性降低，但是具体的过程则是复杂而难以直接描述。为了降低地理种灭绝的风险，并且提高保护的尺度，有必要从形态学、繁殖生物学和分子遗传学等方面全面地对鳡进行研究。进一步的研究，必然要求从更大的地理范围上，使用更多标记和样本数对这泥鳅和鳡进行更详细的遗传结构分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：Abbreviations

声明

Chapter 1 Genetic diversity and population structure of Chinese Misgurnus anguillicaudatus(Cobitidae) as revealed by microsatellite markers

1.1 Review of literature

1.1.1 General overview

1.1.2 Biology of M.anguillicaudatus

1.1.3 Genetics and fisheries management

1.1.4 Population genetics

1.1.5 Testing the basic assumptions for population genetic analysis

1.1.6 Environmental perturbation and population genetics of fish

1.1.7 Hydrological alterations and loach populations in central China

1.1.8 Microsatellites as tool for population genetic study

1.2 Objectives of the study

1.3 Materials and methods

1.3.1 Fish sampling

1.3.2 The pairwise geographical distance between the sampling localities

1.3.3 Flow cytometric screening for ploidy level

1.3.4 DNA extraction of the fish samples

1.3.5 DNA analysis through agarose gel electrophoresis

1.3.6 Spectrophotometric analysis of DNA

1.3.7 Screening of primers for polymorphism

1.3.8 Amplification of microsatellite loci

1.3.9 Polyacrylamide gel electrophoresis

1.3.10 Silver staining

1.3.11 Software and analytical packages

1.3.12 Data analyses

1.4 Results

1.4.1 Genetic diversity

1.4.2 Population genetic structure

1.5 Discussion

1.5.1 Genetic diversity in Chinese M. anguillicaudatus

1.5.2 Population structure

1.5.3 Habitat fragmentation and implications for M. anguillicaudatus

Chapter 2 Genetic diversity, pupulation strucure and phylogenetics of Elopichthys bambusa(Cyprinidae) as revealed by microsatellite markers and cytochrome b sequences

2.1 Review of literature

2.1.1 General overview

2.1.2 Biology of E.bambusa

2.1.3 Spawning of E.bambusa

2.1.4 Interest to fisheries and research

2.1.5 Artificial domestication

2.1.6 Genetics and fisheries management

2.1.7 Population genetics

2.1.8 Testing the basic assumptions for population genetic analysis

2.1.9 Environmental perturbation and populations genetics of fish

2.1.10 Microsatellites as tool for population genetics study

2.1.11 Molecular divergence and phylogeography of Asiatic cyprinids

2.1.12 Mitochondrial DNA as marker for genetic and evolutionary studies

2.2 Objectives of the study

2.3 Materials and methods

2.3.1 Fish sampling

2.3.2 The pairwise geographical distance between the sampling localities

2.3.3 DNA extraction of the fish samples

2.3.4 DNA analysis through Agarose gel electrophoresis

2.3.5 Spectrophotometric analysis of DNA

2.3.6 Amplification, electrophoresis and analyses of microsatellite loci

2.3.7 Amplification, sequencing and analyses of Cyt b sequences

2.4 Results

2.4.1 Results as inferred from microsatellite loci

2.4.2 Results as inferred from Cyt b sequences analyses

2.5 Discussion

2.5.1 Microsatellite diversity in E. bambusa

2.5.2 Mitochondrial diversity

2.5.3 Population structure

2.5.4 The hydrological alterations and E. bambusa spawning

2.5.5 Divergent mtDNA lineages of E. bambusa

2.5.6 Conservation of vulnerable populations

Conclusion and future implications

Literature cited

Curriculum vitae

Acknowledgements