鱼腥蓝细菌PCC 7120中HetN蛋白质生化功能的鉴定以及FtsZ-HetN蛋白质相互作用的研究

摘要

鱼腥蓝细菌PCC7120是一种丝状固氮蓝细菌，在环境中缺乏化合态氮源的时候能够分化异形胞。异形胞以一种半规律的模式分布在菌丝上，异形胞内部提供一种微氧的环境以保证对氧气敏感的固氮酶执行固氮功能。HetN，其生化功能预测为酮酰类还原酶，研究表明HetN对异形胞发育模式的维持是必需的。当hetN基因在细胞内的复制型载体上过量表达时，异形胞的发育受到抑制，但是目前对 HetN在此过程中的确切生化功能仍然知之甚少。
　　在本研究中，我们首次发现HetN体外水解ATP和GTP的活性，并且该活性是依赖于反应体系中镁离子存在的。HetN的催化功能域活性位点 Ser142-Tyr155-Lys159的突变对其水解ATP的活性无显著影响。Lys159突变的hetN在细胞内过量表达的时候失去抑制异形胞发育的功能，推测Lys159为执行该功能的活性氨基酸位点。结果表明HetN的催化功能结构域的活性位点参与HetN在异形胞发育过程中的抑制作用。
　　在本研究中，我们利用酵母双杂与亲和共纯化的方法鉴定了FtsZ与HetN之间的蛋白质相互作用。在鱼腥蓝细菌细胞内过量表达FtsZ的菌株在缺氮48小时的时候可形成多个连续的异形胞，这与hetN缺失的菌株表型类似。FtsZ与HetN之间的互作对HetN体外水解ATP的活性也随着FtsZ在反应体系中摩尔数的增加显示线性促进的影响。HetN催化功能域活性位点 Ser142-Tyr155-Lys159的突变对 FtsZ与 HetN相互作用的影响也进行了研究。结果表明，FtsZ与 HetN之间的蛋白质相互作用可能参与异形胞模式维持的机制。
　　本课题关于HetN的生物化学功能与FtsZ-HetN相互作用的研究结果为鱼腥蓝细菌PCC7120异形胞发育的调控网络研究展开了一个新的视角。

目录

缩 略 语 表

1前言

1.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120中异形胞的发育特点

1.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120中异形胞的发育进程

1.3鱼腥蓝细菌PCC 7120菌丝上细胞之间的交流

1.4 FtsZ 在原核生物中细胞分裂与细胞分化发育的功能

1.5 研究的目的和意义

2.材料和方法

2.1菌株

2.2质粒

2.3引物

2.4培养基配方以及培养条件

2.5常用储存溶液和缓冲溶液配方

2.6实验方法

3. 结果与分析

3.1 hetN、hetR、ftsZ、dnaA的克隆与表达

3.2 HetN、HetR、FtsZ、DnaA和PatA蛋白质的体外表达与纯化

3.3 HetN、HetR和PatA抗血清的制备与纯化

3.4 ftsZoe和hetNoe菌株重组蛋白的亲和纯化及相互作用蛋白的鉴定

3.5 ftsZ启动子结构的分析

3.6 酵母双杂交验证FtsZ与HetN的相互作用

3.7 HetN的生物信息学预测以及生化功能的鉴定

3.8 不同金属离子对HetN水解ATP活性的影响

3.9 FtsZ对HetN水解ATP的活性的影响

3.10 HetN点突变体性质的鉴定

3.11 kaiC及kaiABC突变体的构建

4. 总结与讨论

参考文献

致谢

附录