猪子宫内膜免疫微环境中免疫耐受相关的五种淋巴细胞亚型标记基因的克隆、表达及性状关联分析

摘要

现代生殖免疫学认为，被视为同种半异体移植物的胎儿不被母体免疫系统排斥是一个非常复杂的调节过程，在这个过程中母-胎界面免疫平衡的形成至关重要，这种免疫平衡主要表现为免疫耐受，它受到以下几个方面的影响：细胞免疫抑制，母体外周血和子宫内膜T细胞亚群比例失调，巨噬细胞分泌不同的细胞因子，细胞毒性T细胞(CTL)活性下降，NK细胞杀伤活性明显下降等，由此可见，多种免疫细胞参与到子宫内膜微环境中免疫平衡的建立。
　　免疫细胞以其功能进行分类，每一种免疫细胞都有其相对特异的表面标记。其中，Th1细胞特异因子是T-bet，Th2的特异的转录因子是GATA3，Tregs特异表达转录因子FOXP3，Thl7细胞特异转录RORc因子，巨噬细胞则以白细胞表面抗原 CD14作为其细胞表性的鉴定标志。本研究选取这五个基因为候选基因，对其进行初步的结构和表达分析，为研究猪母-胎界面上这五种免疫细胞的分布及其在母-胎免疫耐受中的作用提供一定的依据。
　　本研究得到的主要结果包括：
　　1．分离得到猪的T-bet和RORc基因的CDS全长；预测了两个基因对应的氨基酸序列，分析了其蛋白质的结构信息；
　　2．筛查了猪CD14、GATA3和RORc基因的SNP位点，发现CD14基因第844位的A>G突变，GATA3基因第1629位的C>T突变，RORc基因第1706位的C>T突变；
　　3．进行了猪CD14基因多态性与大白猪总产仔数，产活仔数以及初生窝重的关联分析，发现该多态位点与第四胎后的初级生窝重显著关联（P值为0.043）。
　　4．进行了猪GATA3和RORc基因多态位点与血液参数的关联分析，初步发现：GATA3基因的多态位点与该多态位点0日龄血小板计数、32日龄淋巴细胞百分比、32日龄淋巴细胞绝对值、32日龄平均红细胞血红蛋白含量、32日龄血小板计数显著关联（P<0.05）。RORc基因多态位点与32日龄红细胞计数、32日龄血红蛋白、32日龄大血小板比率存在显著关联（P<0.05）。
　　5．检测了 GATA3基因在子宫内膜的表达模式，结果显示：该基因在子宫内膜中的表达量，在妊娠前期（妊娠26天）比妊娠中期（妊娠50天）有显著的增加（P＜0.05），而发情母猪、妊娠前期母猪（妊娠15天、26天）子宫内膜中该基因的表达量没有显著变化，妊娠同时期梅山猪和大白猪子宫内膜中该基因表达量也没有显著变化。

目录

声明

本论文涉及的名词表

1．前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.3 研究目的和意义

2.材料与方法

2.1 试验材料

2.2 方法

3 结果

3.1 猪T-bet和RORc基因的分离与序列分析结果

3.2 猪RORc蛋白、T-bet蛋白和FOXP3蛋白的结构域预测

3.3 猪CD14、GATA3和RORc基因的多态性检测结果

3.4 猪CD14基因的多态性与大白猪繁殖性状的关联分析

3.5 猪GATA3和RORc基因与血液参数的关联分析结果

3.6 GATA3基因在猪不同妊娠期子宫内膜中的表达规律

4．讨论

4.1 关于猪的未知基因的克隆技巧

4.2 基因结构与蛋白质功能域的预测

4.3 猪GATA3和RORc基因与血液参数的关联分析

4.4 猪GATA3基因在子宫内膜的表达规律

4.5 NK细胞在子宫内膜微环境免疫耐受中的作用

4.6 本研究存在的问题

5．小结

5.1 本研究的主要结果和结论

5.2 本研究的创新点

5.3 本研究的不足之处

参考文献

附录1猪CD14基因对大白猪群体产仔数的繁殖性状的关联分析

附录2猪GATA3基因位点与血液参数的关联分析结果

致谢