褪黑激素对牛卵母细胞体外成熟及孤性生殖胚体外发育的影响

摘要

褪黑激素(MLT)是一种吲哚类激素,在人及哺乳动物体内主要是由脑部松果腺分泌,其他器官和细胞也有少量分泌,分泌量受光照影响比较大,且呈现昼夜节律性,一般夜晚分泌多,白天分泌少。MLT是一种具有良好水溶性及脂溶性的物质,能够透过细胞膜及各种膜结构进入细胞器来发挥抗氧化作用,还能刺激超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶等抗氧化物酶的活性。目前MLT的抗氧化、抗凋亡作用在小鼠、猪、绵羊、鸡等动物卵母细胞体外成熟及早期胚胎中均有报道,但在牛卵母细胞体外成熟中报道较少。本研究以牛为试验对象,研究了褪黑激素对卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响。
　　主要内容如下:
　　1.褪黑激素对牛卵母细胞成熟和内分泌及代谢机能的影响。
　　(1)褪黑激素对牛卵母细胞成熟的影响取生发泡期(GV期)牛卵母细胞940枚,分成4组,分别用含4种浓度(分别为Opmol/ml、10pmol/ml、20pmol/ml和30pmol/ml)MLT体外成熟培养液在38.5℃、5％CO2、100％湿度条件下培养24h,然后比较各组卵母细胞的成熟率。结果发现,MLT能提高卵母细胞成熟率,且随着浓度的升高,成熟率也呈升高趋势。MLT浓度为30pmool/ml组的卵母细胞成熟率(66.13％)比对照组(30.36％)高一倍多。
　　(2)褪黑激素对卵母细胞生殖激素分泌的影响本试验通过测定添加外源MLT的成熟液中的激素含量,结果表明MLT能显著提高COCs(卵丘卵母细胞复合体)的激素分泌从而提高成熟液中激素的含量,其中:孕酮(P)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)的分泌是随MLT浓度的升高呈上升趋势,MLT浓度为30pmol/ml时的P水平(0.35mIU/ml)约为对照组(0.06mIU/ml)的6倍;促黄体素(LH)水平在10pmol/ml组和20pmol/ml组比对照组减少,但是30pmol/ml组则高于对照组(5.42 vs.3.97,P＜0.05)。
　　(3)褪黑激素对牛卵母细胞ROS水平的影响测定用不同浓度MLT处理的卵母细胞成熟液中活性氧(ROS)水平,发现MLT能明显降低牛卵母细胞中的ROS水平,这种降低作用与MLT浓度呈负相关关系。
　　2.褪黑激素对牛孤雌胚胎发育的影响及其作用机制在胚胎培养液SOF中添加Opmol/ml、10pmol/ml、20pmol/ml、30pmol/ml MLT,培养7d后发现,MLT可以提高孤雌胚胎的卵裂率、桑葚胚率及囊胚率,特别当MLT浓度为10pmol/ml时,卵裂率(70.23％)约比对照(42.32％)高30个百分点,桑葚胚率(66.09％)是对照组(31.54％)的两倍多,囊胚率(23.90％)约是对照组(6.00％)的4倍。与对照组相比,囊胚率较高(MLT浓度为10pmol/ml)的组的内细胞团数、滋养层细胞数及总细胞数都有显著增加(34.67 vs.19.66,71.33 vs.43.67,106.00 vs.63.33,P＜0.05),说明MLT可能通过提高牛孤雌胚胎的细胞数而促进胚胎的发育。应用免疫组化方法检测各发育阶段牛孤雌胚胎的MLT受体,证明孤雌胚胎中有MLT受体表达,MLT受体多在胚胎的表面表达,且随着胚胎的发育,受体的表达有增多的趋势。
　　3.褪黑激素对牛孤雄胚胎发育的影响在胚胎培养液SOF中添加Opmol/ml、10pmol/ml、20pmol/ml、30pmol/ml MLT,培养7d后,发现MLT可以提高孤雄胚胎的卵裂率、桑葚胚率及囊胚率,卵裂率30pmol/ml(77.25％)相比于对照(55.46％)提高了20％左右;桑葚胚率20 pmol/ml(38.06％)是对照(19.22％)的两倍;囊胚率20 pmol/ml(10.96％)比对照(0％)提高了10％。

目录

摘要

Abstract

缩略词表

前言

第一章:文献综述

1 褪黑激素及其受体研究进展

1.1 褪黑激素研究进展

1.2 褪黑激素受体的研究进展

2 褪黑激素对卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

2.1 卵母细胞成熟的机制

2.2 卵母细胞成熟的影响因素

2.3 褪黑激素在卵母细胞成熟中的作用

2.4 褪黑激素对胚胎发育的影响

3 小结

第二章 褪黑激素对卵母细胞体外成熟的影响

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 数据统计

3 结果与分析

3.1 褪黑激素对牛卵母细胞成熟的影响

3.2 褪黑激素对卵母细胞生殖激素分泌的影响

3.3 褪黑激素对牛卵母细胞ROS水平的影响

4 讨论

4.1 褪黑激素对牛卵母细胞体外成熟的影响

4.2 褪黑激素对卵母细胞生殖激素分泌的影响

4.3 褪黑激素对牛卵母细胞ROS水平的影响

5 小结

第三章 褪黑激素对孤性生殖胚体外发育的影响

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 数据统计

3 结果与分析

3.1 褪黑激素对牛孤雌胚胎发育的影响

3.2 褪黑激素对牛孤雌胚胎细胞数的影响

3.3 牛孤雌胚中褪黑激素受体的表达情况

3.4 褪黑激素对牛孤雄胚胎发育的影响

4 讨论

4.1 褪黑激素对牛孤雌胚发育的影响

4.2 褪黑激素对孤雌胚胎细胞数的影响

4.3 牛孤雌胚中褪黑激素受体的表达情况

4.4 褪黑激素对牛孤雄胚胎发育的影响

5 小结

参考文献

附表

致谢