猪PRDX2和PRDX6基因的分离及遗传效应分析

摘要

PRDX2和PRDX6基因同属于抗氧化蛋白超家族,该家族基因编码的蛋白能通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物,消除代谢产生的过氧化物,发挥抗氧化和清除自由基的作用。本实验室在研究典型瘦肉型猪种(大白)和脂肪型中国地方猪种(梅山)两种不同品种猪骨骼肌形成的分子机理时,应用差异蛋白质组学筛选出了PRDX2和PXDR6两个差异蛋白。鉴于此,本研究选择PRDX2和PXDR6作为猪肌肉品质的候选基因,开展了基因结构、时空表达谱、多态性及性状关联分析等方面的研究,获得如下结果:
　　 1、获得猪PRDX6基因765 bp长度的cDNA序列,运用GENSCAN预测开放阅读框,其中编码区675 bp,预测编码224个氨基酸；利用猪PRDX6的cDNA全长在猪核酸数据库中进行比对,发现和猪9号染色体一个基因组克隆(pig clone CH242-230A16)完全匹配,发现猪PRDX6基因组全长达168 kb,包含5个外显子；通过Spidey程序以及不同物种间剪切位点的保守性分析基因结构,结果表明猪PRDX6基因的4个内含子的剪切方式均符合“gt-ag”法则。
　　 获得了猪PRDX2基因611 bp长度的cDNA序列,运用GENSCAN预测开放阅读框,其中编码区597 bp,预测编码198个氨基酸；利用猪PRDX2的cDNA全长在猪核酸数据库中进行比对,发现和猪2号染色体一个基因组克隆(pig clone CH242-275M24)完全匹配,发现猪PRDX2基因组全长达181 kb,包含6个外显子,5个内含子。通过Spidey程序以及不同物种间剪切位点的保守性分析基因结构,结果表明猪PRDX2基因的5个内含子的剪切方式均符合“gt-ag”法则。
　　 2、运用荧光定量RT-PCR分析猪PXDR6基因在不同品种间及不同发育时期的RNA水平上是否存在差异。实验结果表明:大白猪PRDX6基因在RNA水平上出生后4M高表达,和蛋白质组学得到的结果一致；大白猪PRDX2基因在RNA水平上出生后2M高表达,和蛋白质组学得到的结果(PRDX2蛋白在胚胎期65天高表达)不一致。
　　 3、运用荧光定量RT-PCR技术对PRDX2和PXDR6基因进行组织表达谱分析。结果表明:大白猪PRDX6基因在肝和股二头肌中高表达,在胃中中度表达,其他组织相对低表达。大白猪PRDX2基因在胃中高表达,肝和肾中中度表达,脾中低表达,在其他组织中相对低表达。
　　 4、对大白和梅山猪PRDX6基因序列对比,发现编码区第4外显子处有2个潜在的SNPs分别在第417 bp处(C/T突变)和第423 bp处(A/G突变),但均没有引起氨基酸的变化。采用焦磷酸测序方法对这两个位点在6个猪种和247头F2“大白×梅山”资源家系中作了遗传变异分析和性状关联分析。结果表明:C417T位点国外品种均以C等位基因为主,国内品种均以T等位基因为主,该位点与肌内脂肪、肌肉水分相关；A423G位点国外品种均以A等位基因为主,国内品种以G等位基因为主,该位点与失水率、系水力、肌内脂肪、肌肉水分相关。
　　 5、采用PCR方法扩增了猪PXDR6基因5’侧翼2000bp的序列,利用生物信息学方法预测了猪PXDR6基因CpG岛的分布和转录因子结合位点。
　　 6、猪PRDX6基因时空表达与此基因甲基化程度的相关性分析:(1)大白猪蛋白及mRNA表达量趋势基本一致,而其甲基化程度与表达量趋势相反,且在4M表达量最高,甲基化程度也相应明显最低。梅山猪表达量与甲基化程度不具有负相关性。(2)除脑、肾组织外,其他组织表达量与甲基化程度呈较好的负相关。