表面增强拉曼探针的构建及其用于常见猪疾病的检测

摘要

表面增强拉曼散射（SERS）因具有独特的谱带窄、灵敏度高、选择性好、原位无损等优点，而广泛用于药物、食品安全、疾病、爆炸物、成像、矿物质和考古等领域。我国是农业大国，养殖业是广大农民收入不可或缺的重要支柱。据不完全统计，我国每年养猪约10亿头，占世界养猪总量的一半，但是猪传染病严重阻碍养猪业的发展，这些疾病的爆发和蔓延给生猪养殖业带来了巨大的经济损失。因此，发展简便、快速、低成本的猪传染病检测新方法，对控制疾病的传播和减小经济损失具有重要意义。本论文从SERS基底的合成和表征、探针的构建、方法的建立及其应用等方面进行研究，主要内容如下：
　　1.以三羟甲基氨基甲烷作为还原剂和导向剂，一步法制备高质量多枝纳米金粒子。此方法不需要任何表面活性剂或金种，所获得的多枝纳米金具有很好的分散性，通过改变加入还原剂的量，它的紫外可见光谱可以从可见区域调控到近红外区。系统考察了三羟甲基氨基甲烷的浓度、反应的时间、酸度等因素对所合成多枝纳米金形貌的影响，并且对多枝纳米金的形成机制进行了讨论。以对巯基苯甲酸作为拉曼信号分子，用聚乙烯吡咯烷酮包裹，构建SERS活性探针用于奶牛肾脏细胞成像。结果表明，探针被细胞吞噬，分布在细胞膜上。说明了多枝纳米金具有很好的生物相容性和较高的拉曼活性，可用于成像和疾病检测等应用。
　　2.以多枝纳米金为SERS为增强基底，构建SERS免疫探针用于PCV2的检测。用标记分子pMBA对多枝纳米金进行标记，通过1-乙基-3-（3-二甲氨基）碳二亚胺（EDC）活化对巯基苯甲酸上的羧基，将PCV2单克隆抗体偶联到多枝纳米金上。根据抗原抗体反应，吸附在酶标板上的PCV2捕获到多枝纳米金探针，通过采集探针的拉曼信号来实现对PCV2的检测。结果表明，在8×102～8×106 copies/mL浓度范围下，具有较好的线性，最低检出限为8×102 copies/mL。对16份临床血清进行检测，与传统方法（PCR）相比，具有较高的阳性（87.5％）和阴性（75％）符合率。体现了本方法在预防、诊断和控制动物源性疾病等方面有着巨大应用潜力。
　　3.制备了对巯基苯胺嵌入Au/Ag核壳纳米粒子，对所制备的核壳纳米粒子的SERS活性进行了系统的研究。结果表明，通过调节银纳米壳的厚度SERS活性可以有效进行调整，当银纳米壳厚度为10 nm时，以1077 cm-1处的拉曼强度计算，Au/Ag核壳纳米粒子的最大增强因子（EF）可达3.4×104。并且利用所制备纳核壳纳米粒子构建溶菌酶释放蛋（MRP）的SERS探针，开发了一种新的MRP的免疫传感器，在优化的条件下，以1077 cm-1处的峰强度与MRP浓度在0.01至10 ng/mL的范围内的呈线性关系，线性回归方程为Y=-1384x+18986，其相关系数R2为0.9534(n=5)。结果表明，这种基于SERS的检测方法对 MRP的检测具有很高的灵敏度，有潜力应用于其他蛋白标志物的检测。
　　4.以单个磁性微球为固相载体，构建免疫磁性微球-病毒-免疫硅包银核壳探针三明治检测模型，定点同时检测猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒，采用不同的标记分子（MBA、RBITC）标记金银核壳纳米粒子，偶联不同的抗体（PCV2、PRV），构建两种有靶标功能的免疫硅包银核壳纳米探针。通过免疫反应，免疫复合物在磁球微球上形成。在普通的显微镜下，单个颗粒的磁性微球能够被识别和任意的测定；在磁球上获得拉曼信号实现了对PCV2和PRV的同时检测，提高了检测效率。这种方法具有快速、易分离、多组分检测等优点，为检测其他疾病标志物和生物大分子提供方法学依据。
　　5.基于多孔碳膜构建高灵敏、可循环使用的SERS基底。通过疏水作用，在多孔碳膜上组装疏水性的纳米银，采用紫外可见光谱、电子透射显微镜、X-射线粉末仪和激光拉曼光谱仪等手段对所合成的 SERS基底进行了表征，结果表明了疏水性的纳米银能很好的组装在多孔碳膜上。以结晶紫和孔雀石绿为研究对象，考察了所合成基底的可循环使用性和拉曼活性，结果显示，该基底具有很高的表面增强拉曼活性，可循环使用的周期为3次。而且，将所合成的基底直接用于猪圆环病毒2型、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒等病毒的检测，探讨了表面增强拉曼散射技术直接检测病毒的可能性，采集相关拉曼光谱，采用主成分分析对数据进行处理，成功地区分了三种病毒，显示了所合成的SERS基底具有良好的实际应用前景。

目录

声明

缩写名词表

第一章 绪论

1 表面增强拉曼散射

2动物（猪）疾病简介

3猪疾病检测方法及研究现状

4研究论文思路及其意义

第二章 聚合物包裹多枝纳米金SERS探针的制备及其用于细胞成像

1前言

2材料与主要仪器

3实验方法

4结果与讨论

5结论

第三章 构建多枝金纳米SERS探针用于猪圆环病毒2型的检测

1前言

2材料与主要仪器

3实验方法

4结果与讨论

5结论

第四章 新型金银核壳SERS探针的合成及其用于猪链球菌病的检测

1前言

2材料与主要仪器

3实验方法

4结果与讨论

5结论

第五章 硅包银核壳SERS探针结合磁性微球同时检测猪圆环病毒2型，伪狂犬病毒

1前言

2 材料与主要仪器

3实验方法

4结果与讨论

5结论

第六章 高灵敏、可循环的纳米银修饰多孔碳膜SERS基底的合成及其用于几种猪疾病的检测

1前言

2材料与主要仪器

3实验方法

4结果与讨论

5小结

全文总结

参考文献

致谢

附录