鸡蛋孵化早期蛋清抗微生物特点及其作用机制

摘要

鸡蛋蛋清具有独特的物理特性和丰富的化学因子，有可能在防止微生物感染、保证卵黄内营养物质免受破坏、保持胚胎活性等方面发挥重要作用。本研究以孵化早期鸡胚蛋蛋清为研究对象，深入挖掘孵化蛋清抗菌特性及其作用机制，旨在揭示蛋清抗菌因子在孵化条件下的作用特点及相互作用关系。主要开展以下三个方面的研究：(1)孵化早期蛋清抗菌防御体系变化及其对鸡蛋蛋清抗菌功能的影响；(2)孵化早期蛋清抗微生物防御作用机制研究；(3)蛋清蛋白质抗菌相互作用关系研究。具体研究内容和结果如下：
　　 研究测定了孵化早期蛋清基本理化性质及体外抗菌活性的变化。结果表明，蛋清pH值在孵化约48 h后上升至最高值，而蛋白高度下降到最低值；之后，蛋清pH值开始降低，蛋清开始浓缩，浓蛋清及稀蛋清粘度均快速上升。孵化早期蛋清的理化性质的变化直接影响蛋清的体外抗菌功能。孵化第2d胚蛋蛋清抗菌功能明显增强，尤其是抑制革兰氏阴性菌肠炎沙门氏菌的作用。孵化2d后，随孵化时间的延长，胚蛋蛋清的抑菌功能明显减弱，到孵化第5d时，胚蛋蛋清抑制革兰氏阴性菌的作用能力几乎消失。
　　 卵转铁蛋白和溶菌酶是蛋清内含量最丰富的两种抗菌功能性蛋白质。研究通过SDS-PAGE和RP-HPLC技术对不同孵化阶段蛋清内卵转铁蛋白和溶菌酶含量及活性变化进行了测定。结果显示，随着孵化时间的延长，卵转铁蛋白的浓度不断增加，而溶菌酶的浓度变化很小。表明溶菌酶在禽蛋孵化早期可能存在一定程度上的降解。蛋清总铁结合力不断增强，在孵化第5d时，达到最高值23.78±0.65 mg/mL。蛋清溶壁活性在孵化0d时约为30397±2280 U/mg，孵化2天后降至15036±2574 U/mg。随后，蛋清溶壁活性开始缓慢增加，这种变化可能与孵化蛋清内动态变化的pH有关。
　　 研究采用凝胶层析结合MALDI-TOF MS技术对孵化早期蛋清内小分子量(LMW)蛋白质(肽)组成变化进行监测，从而揭示孵化早期蛋清蛋白质体系的稳定性。研究显示，孵化早期蛋清内LMW蛋白质组成是高度动态变化的。孵化早期(0～5d)蛋清内共出现114个LMW蛋白质信号峰，荷质比分布范围为1035.88～7112.91m/z，不同孵化阶段蛋清内LMW蛋白质组成差异很大。其中，共有28、26、35、35、20、17种LMW蛋白质分别出现在孵化0d、1d、2d、3d、4d、5d蛋清内。研究证实，孵化早期蛋清内部分大分子蛋白质会发生降解。
　　 孵化早期浓蛋清的液化、粘度的下降可能与蛋清内部蛋白质分子间的相互作用或蛋白质的降解有关。比较研究孵化早期浓稀蛋清抗菌特性发现：孵化早期浓蛋清与稀蛋清pH、溶菌酶、卵转铁蛋白含量无明显差异。浓稀蛋清转铁活性、溶壁活性、抗菌活性的变化趋势一致。孵化早期蛋清的液化可能减弱其物理防御作用，甚至导致蛋清抗菌蛋白质溶菌酶的降解或影响蛋清内部蛋白质间的相互作用关系，然而孵化过程中形成的碱性pH环境及逐渐增强的卵转铁蛋白活性可能弥补这种减弱作用。
　　 采用cFDA和PI染料对孵化蛋清作用后的肠炎沙门氏菌进行荧光染色，并在荧光显微镜下进行检测分析。结果表明，在蛋清的环境应激之下，肠炎沙门氏菌表现出三种生存状态：活菌、死菌、膜受损状态。采用流式细胞仪技术对不同群体特征的菌群进行定量分析发现，不同孵化阶段蛋清抑制肠炎沙门氏菌的作用效力存在较大差异。蛋清抑制肠炎沙门氏菌的主要作用机制可能是破坏细菌膜结构，这种作用在孵化温度条件下得到增强；孵化过程中形成的碱性pH环境能够促进蛋清破坏细菌膜结构的作用效力。
　　 通过SEM技术观察孵化蛋清作用后肠炎沙门氏菌细胞形态结构变化发现，细菌细胞表面表观结构发生变化。采用细胞活性荧光探针(SYTO9/PI)对孵化蛋清处理后的肠炎沙门氏菌菌群进行荧光染色后发现，经孵化蛋清处理后的细菌群体呈现红、绿两种荧光，进一步证明孵化蛋清能够对肠炎沙门氏菌膜结构产生损伤，使其在蛋清内呈现不同的活性状态。研究采用流式细胞仪技术对经蛋清处理后呈现不同活性状态的细菌群体进行定量分析。结果表明，与新鲜鸡蛋蛋清相比，孵化1d、2d、3d鸡蛋清对肠炎沙门氏菌膜结构的破坏作用能力均有所增强。其中，孵化2d蛋清作用效力最强。孵化早期蛋清还能够抑制肠炎沙门氏菌hilA基因的表达，减弱其黏附及入侵Caco-2细胞活性。
　　 采用细菌活性荧光探针(SYTO9/PI)标记技术结合流式细胞仪技术，体外模拟研究了蛋清抗菌因子卵转铁蛋白、溶菌酶在孵化早期过程中的协同抗菌作用效果。研究发现，在体外条件下，卵转铁蛋白能够破坏肠炎沙门氏菌的膜结构；溶菌酶抑制肠炎沙门氏菌的作用能力相对较弱。当环境pH增加时，卵转铁蛋白、溶菌酶抗肠炎沙门氏菌的作用活性均增强。卵转铁蛋白与溶菌酶联合使用时，对肠炎沙门氏菌具有协同抗菌作用，并且碱性pH(9.5)条件能够促进两者的协同抗菌作用效果。卵白蛋白本身不具备抑制肠炎沙门氏菌的作用效果，然而在碱性条件下，卵白蛋白的浓度变化能够影响溶菌酶及卵转铁蛋白的协同抗菌作用效果。可见，孵化早期禽蛋蛋清蛋白质及其作用环境之间存在复杂的抗菌相互作用关系。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一章 绪论

1 蛋清抗菌特性

2 蛋清抗菌作用机制

3 蛋清抗菌蛋白质成份的发掘与鉴定

3.1 溶菌酶

3.2 卵转铁蛋白

3.3 抗生物素蛋白

3.4 蛋白酶抑制剂

3.5 其它

4 贮藏过程中蛋清的抗微生物防御特点

5 禽胚胎发育过程中蛋清的免疫防御特点

5.1 蛋清的消化和吸收

5.2 蛋清免疫防御特点

6 蛋清抗菌活性成份的开发与应用价值

7 本课题主要研究内容及研究意义

7.1 主要研究内容

7.2 技术路线

7.3 研究意义

第二章 鸡蛋孵化早期蛋清基本理化性质变化及其体外抗菌活性评价

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 种蛋孵化及蛋清分离取样

1.4 蛋清pH值测定

1.5 蛋白高度测定

1.6 不同发育阶段蛋清粘度测定

1.7 菌种活化与接种

1.8 细菌计数

1.9 数据分析

2 结果与分析

2.1 蛋清pH变化

2.2 蛋清蛋白高度变化

2.3 蛋清粘度变化

2.4 孵化蛋清对细菌生长曲线的影响

3 小结

第三章 鸡蛋孵化早期蛋清主要抗菌蛋白含量及活性变化

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 种蛋孵化及蛋清分离取样

1.4 SDS-PAGE

1.5 RP-HPLC

1.6 溶壁活性测定方法

1.7 转铁活性测定方法

1.8 试验设计

1.9 数据处理

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE

2.2 孵化过程中蛋清内卵转铁蛋白、溶菌酶含量的变化

2.3 孵化早期蛋清溶壁活性及转铁活性变化

3 小结

第四章 鸡蛋孵化早期蛋清小分子蛋白质组成变化

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 蛋清样品的准备

1.4 蛋清蛋白质片段粗分离

1.5 MALDI-TOF MS分析

2 结果与分析

3 小结

第五章 孵化早期蛋清液化及其对蛋清抗菌功能的影响

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 种蛋孵化及蛋清分离取样

1.4 浓稀蛋清分离

1.5 pH值测定

1.6 RP-HPLC分析

1.7 溶壁活性测定方法

1.8 转铁活性测定方法

1.9 体外抗菌活性评定

1.10 试验设计

1.11 数据统计

2 结果与分析

2.1 孵化早期浓稀蛋清pH的变化

2.2 孵化早期浓稀蛋清抗菌蛋白含量的变化

2.3 孵化早期浓稀蛋清溶壁活性及转铁活性的变化

2.4 孵化早期蛋清液化对浓稀蛋清体外抗菌活性的影响

3 小结

第六章 孵化早期蛋清内肠炎沙门氏菌活性状态评定

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 种蛋孵化及蛋清分离

1.4 菌悬液的准备及接种

1.5 细菌分离及荧光染色方法

1.6 荧光显微镜检测方法

1.7 流式细胞仪分析检测方法

1.8 细菌计数

1.9 试验设计

1.10 数据分析

2 结果与分析

2.1 肠炎沙门氏菌荧光染色特征

2.2 孵化早期禽蛋蛋清抑制肠炎沙门氏菌的作用效力

2.3 孵化温度对肠炎沙门氏菌在蛋清内的活性状态的影响

2.4 pH对肠炎沙门氏菌在蛋清内的活性状态的影响

3 小结

第七章 鸡蛋孵化早期蛋清抗肠炎沙门氏菌机制

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 种蛋孵化及蛋清分离取样

1.4 菌悬液的活化及接种

1.5 细菌分离及荧光染色方法

1.6 扫描电镜观察方法

1.7 荧光显微镜观察

1.8 流式细胞仪检测

1.9 细菌RNA提取及荧光定量PCR

1.10 细菌黏附细胞毒性评定

1.11 数据分析

2 结果与分析

2.1 孵化蛋清对肠炎沙门氏菌显微特征的影响

2.2 孵化早期蛋清对肠炎沙门氏菌膜结构的破坏作用效力

2.3 孵化早期蛋清对肠炎沙门氏菌毒性基因的表达影响

2.4 孵化早期蛋清对肠炎沙门氏菌细胞毒性的影响

3 小结

第八章 孵化早期蛋清抗菌蛋白质协同作用效果及其影响因素

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 主要仪器与设备

1.3 菌悬液的准备

1.4 最小抑菌浓度的测定(MIC)

1.5 蛋白质溶液及抗菌反应体系的配制

1.6 细菌的计数

1.7 菌液荧光染色及流式细胞仪检测

1.8 试验设计

1.9 数据分析

2 结果与分析

2.1 卵转铁蛋白、溶菌酶抗菌作用效果

2.2 卵转铁蛋白与溶菌酶协同作用效果及pH的影响

2.3 卵白蛋白环境对溶菌酶及卵转铁蛋白协同作用效果的影响

3 小结

第九章 结论与展望

1 结论

2 展望

3 创新性

参考文献

致谢

作者简介