硫化叶菌超表达载体特性和阿拉伯糖操纵子表达调控的研究

摘要

一直以来嗜热古菌重组蛋白同源表达缺少成熟的遗传表达体系和面临在大肠杆菌等异源宿主体内表达时容易形成包涵体等问题，这给嗜热古菌关键蛋白功能的深入研究带来很多困难。为了解决这个难题，本实验室研究人员在硫化叶菌-大肠杆菌穿梭载体pZC1的基础上，构建了一系列硫化叶菌超表达载体，用以在硫化叶菌体内表达目的蛋白。这一系列载体包括pEXA、paraS1、paraS2、p10b、p7d和pSeSD。本研究发现，拥有阿拉伯糖启动子和RBS的pSeSD载体与其他载体相比，在目的蛋白的表达量方面具有较大优势。另外，本研究还发现硫磺矿硫化叶菌在表达同一目的蛋白时有一定的起始密码子偏好性，活性最高的起始密码子是ATG，最低的是GTG。
　　 硫磺矿硫化叶菌糖代谢基因常以操纵子形式存在，阿拉伯糖操纵子便是其中的一个例子，该操纵子由araS/T/U/V四个基因依次排列组成，能够在阿拉伯糖的诱导下分别表达出阿拉伯糖结合蛋白(AraS)，膜透性蛋白(AraT/U)和一个具有ATP酶活性的蛋白(AraV)。因此对araS操纵子进行研究对于揭示古菌操纵子表达调控模式具有十分重要的意义。本研究首先通过报告基因法证实在阿拉伯糖操纵子不存在内部启动子，然后通过RT-PCR实验进一步确定了，阿拉伯糖操纵子的四个基因araS/T/U/V由阿拉伯糖(araS)启动子单独控制转录到同一条mRNA上。但是荧光定量PCR实验结果却显示，在硫磺矿硫化叶菌细胞内操纵子第一个基因araS的mRNA水平约是第二个基因araT的9倍。这表明araS和araT之间序列行使转录弱化的功能，预示着古菌操纵子内部存在着一种特殊的转录调控模式。进一步分析发现虽然araS和araT之间的序列间隔长度为35bp，并富含连续的A和T序列，可能作为非完全转录终止/弱化元件。但无论是用这段序列在NCBI序列库中进行BLAST比对，还是用这段序列同硫磺矿硫化叶菌P2菌株基因组上其他操纵子内部非翻译序列进行比对，都没有发现与之相近的序列，因此推测该元件不存在序列保守性而是存在类终止子的颈环结构相似性。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 古菌简介

1．2 硫化叶菌简介

1．3 古菌转录起始简介

1．4 翻译起始简介

1．5 硫磺矿硫化叶菌阿拉伯糖操纵子简介

1．6 硫化叶菌遗传操作体系简介

2 材料与方法

2．1 菌株和质粒

2．2 培养基配方及培养条件

2．3 主要分子生物学实验试剂及实验仪器

2．4 实验方法

2．4．1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

2．4．2 冰岛硫化叶菌E233S感受态细胞的制备

2．4．3 大肠杆菌DH5α热击转化法

2．4．4 硫化叶菌电转化

2．4．5 SDS-PAGE电泳

2．4．6 报告基因质粒的构建

2．4．7 构建硫磺矿硫化叶菌蛋白表达密码子偏好性系列载体

2．4．8 构建使用不同启动子表达蛋白的重组载体

2．4．9 构建验证阿拉伯糖操纵子组成基因araT上游是否有内部启动子存在的一系列融合载体

2．4．10 B-galactosidase(LacS)酶活分析

2．4．11 硫化叶菌总RNA的提取

2．4．12 反转录PCR和荧光定量PCR

3 结果与分析

3．1 pSeSD在蛋白表达能力方面优势明显

3．2 ParaS-SD组合比P7d和P10b启动子活性高

3．3 硫化叶菌蛋白表达最偏好的起始密码子为ATG，活性最低的起始密码子为GTG

3．4 未发现硫化叶菌阿拉伯糖操纵子内部启动子

3．5 确定硫磺矿硫化叶菌阿拉伯糖启动子的共转录

3．6 发现阿拉伯糖操纵子内部存在明显的转录调控

3．7 S．soP2操纵子内部基因间UTR序列无保守性，但富含A／T特征明显

4 讨论

4．1 超表达载体pSeSD的成功构建以及对其特性的研究对古菌研究的意义

4．2 阿拉伯糖操纵子转录调控机制

4．3 基因间非翻译区序列对操纵子转录进行调控的意义

参考文献

附录

硕士期间学术成果

致谢