一个研究拟南芥茎向根生长素运输机制的新系统的建立及基于该系统的EMS突变体库的构建与筛选

摘要

拟南芥作为一种双子叶模式植物，在植物发育研究中发挥着不可替代的作用。生长素(auxin)是一种重要的植物激素，在植物尤其是根系的生长发育过程中起着重要的调控作用。生长素主要在分生组织和植物的幼嫩部位合成，其中以茎尖分生组织(SAM)和根尖分生组织(RAM)较为显著。生长素主要靠其特有的运输方式-极性运输，进行远距离和近距离运输至植物的各个部位进而发挥其重要功能。生长素的极性运输主要由在质膜(plasmamember,PM)上不对称分布的运输蛋白决定，这些蛋白主要包括:输入载体（主要是AUX/LAX蛋白家族）和输出载体（PIN蛋白家族和PGP蛋白家族）。茎尖合成的生长素在中央维管组织中由PIN1介导运输至根茎交界处，进入根中，在PIN3、PIN4和PIN7协助下运输至根尖，此时汇聚根尖合成的生长素，主要在PIN2介导下侧向运输至根的伸长区，再在PIN3和PIN7的辅助下重新汇入中柱，如此反复，从而形成根尖生长素回流（‘auxinreflux'loop）现象。该现象对维持静止中心功能，根中生长素浓度梯度及向性生长发挥着至关重要的作用。
　　 本研究以拟南芥为材料，旨在筛选出与生长素由茎尖向根尖运输过程相关的突变体，进而探究茎尖合成的生长素在根发育过程中的作用和茎向根生长索运输的机制。本研究构建了在茎顶端分生组织(SAM)定点合成生长素的CLV3::IAAH-DR5::GFP拟南芥转基因体系。外源施加生长素前体物质IAM处理上述转基因拟南芥后则会在茎尖定点合成大量生长素，该部位合成的生长素通过长距离运输至根尖，可由DR5::GFP表达载体实时指示生长素在根尖的表达模式及累积程度。以上述材料为研究背景，通过构建EMS（甲基磺酸乙酯）突变体库，进而以根毛数目、荧光强度、主根长度、侧根数目、下胚轴长度及根的向地性为指标，筛选出特异影响拟南芥茎尖向根尖牛长素运输的突变体。该研究成果将进一步揭示茎失生长素至根尖的运输机制，对茎尖合成的生长素在根发育过程中的作用也将会有新的突破。
　　 目前获得的主要研究结果如下:
　　 1)选用不同浓度的IAM对CLV3::IAAH-DR5::GFP拟南芥材料进行处理，结果表明20nmol/LIAM处理7d时，主根长与未处理的对照组表现出显著差异，确定该浓度为EMS突变体库的筛选浓度，并确定了该浓度下观察各筛选指标的时间。探索外源生长素及其运输抑制剂NPA处理浓度的结果表明，5nmol/L2，4-D、80nmol/LNAA和40nmol/LIAA均可以促进该材料主根的伸长，20nmol/L2，4-D、300nmol/LNAA和150nmol/LIAA则抑制主根长度，而10μmol/LNPA处理表现出向地消失表型。
　　 2)成功构建了EMS突变体库，并收获M2代2124份种子。
　　 3)以根毛数目、荧光强度、侧根数目、主根长度、下胚轴长度和向地性为指标，对EMS突变体库进行初筛和多次复筛，结果确定了64个家系可稳定遗传并与系统相关的突变体。对这些突变体进行高浓度IAM(1000nmol/L)、外源生长素及其抑制剂NPA处理，结合杂交及DIC拍照等一系列实验，最后把这些突变体分为13类，而且每类突变体内部之间表型也有所差异。筛选出的诸多突变体将会为生长素茎向根运输机制及其生物学功能的研究提供重要遗传材料。

目录

声明

摘要

缩略语

1 前言

1．1 拟南芥茎尖分生组织(SAM)形态与调控机制

1．1．1 拟南芥SAM的组织学特征

1．1．2 SAM调控的分子机制

1．2 拟南芥根系的形态结构

1．3 生长素的研究进展

1．3．1 生长素的合成机理

1．3．2 生长素的极性运输

1．3．3 生长素地上部分向地下部分的运输

1．4 EMS突变体库的研究进展

1．4．1 EMS诱变的原理

1．4．2 EMS突变体库的应用

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 拟南芥材料

2．1．2 1／2MS培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2 方法

2．2．1 种子灭菌及种植

2．2．2 拟南芥EMS突变体库的构建

2．2．3 外源激素处理

2．2．4 CTAB法抽提拟南芥基因组DNA

2．2．5 Trizol试剂提取拟南芥RNA

2．2．6 反转录cDNA

2．2．7 Lugol’s染色及DIC拍照

2．2．8 杂交

3 结果与分析

3．1 实验系统的建立和EMS突变体库筛选程序的确定

3．1．1 CLV3∷IAAH-DR5∷GFP体系的构建成功

3．1．2 EMS突变体库筛选条件的确定

3．2 外源生长素及NPA处理浓度的确定

3．3 EMS突变体库的构建

3．4 EMS突变体库的筛选结果

3．4．1 根毛突变体

3．4．2 根毛少，侧根少，主根长突变体

3．4．3 根毛多且短突变体

3．4．4 向地性消失突变体

3．4．5 下胚轴长突变体

3．4．6 短根突变体

3．4．7 根毛少突变体

3．4．8 侧根少，主根长突变体

3．4．9 根毛少，侧根少突变体

3．4．10 主根长突变体

3．4．11 侧根少突变体

3．4．12 根毛和侧根少且短，主根长突变体

3．4．13 只有根毛突起的突变体

4 讨论

4．1 研究体系

4．2 研究方法

4．3 EMS突变体库的筛选及意义

4．4 EMS突变体库的局限性

4．5 结语

参考文献

致谢