调控DNMT1对胎牛成纤维细胞细胞增殖、周期、凋亡的影响

摘要

体细胞核移植技术作为一项发展日益成熟的技术，在很多领域都显示出了广阔的应用前景。但是，体细胞核移植技术的效率很低，这也成为了限制其发展的最大障碍，其中表观遗传修饰异常被认为是导致体细胞核移植效率低的主要原因之一。DNMT1在维持基因组甲基化的过程中发挥着重要的作用，其对克隆胚胎发育相关基因的正常表达十分重要。
　　本研究使用不同浓度的5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理胎牛成纤维细胞，并设计三条不同的DNMT1特异性siRNA片段转染胎牛成纤维细胞，研究不同处理对胎牛成纤维细胞的增殖能力、细胞活力、周期、凋亡的影响，并检测DNMT1基因在胎牛成纤维细胞中的表达水平，从而获得不同处理对胎牛成纤维细的影响，为DNMT1的研究以及核移植供体细胞的选择提供参考。主要研究结果如下:
　　1.不同浓度5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胎牛成纤维细胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表达水平的影响。
　　选用0、0.01、0.1、0.5、1μmol/L的5-aza-CdR处理胎牛成纤维细胞。结果显示:经96h连续测定发现，与空白对照组相比，实验组细胞的增殖速度和细胞活力随处理时间的延长而下降，且随着5-aza-CdR浓度的增高，其对胎牛成纤维细胞增殖的抑制作用越显著，细胞活力下降越快;24-96h，较高浓度（0.5、1μmol/L）的5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)，且在48-72h细胞活力显著下降(p＜0.05)。24-72h，0.5、1μmol/L的5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞的G0/G1期具有显著的抑制作用(p＜0.05);除了0.01μmol/L的5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞的凋亡影响不显著以外，其余各组与对照组相比均对胎牛成纤维细胞的凋亡有显著影响(p＜0.05)。48h，经0.5、1μmol/L的5-aza-CdR处理后，胎牛成纤维细胞中DNMT1的表达水平分别下降了14％和24％。综上所述，较高浓度的5-aza-CdR虽然可以下调DNMT1的表达水平，但是却对细胞的生长不利，只有低于0.1μmol/L的5-aza-CdR适宜用作处理胎牛成纤维细胞。
　　2.不同DNMT1特异性siRNA片段对胎牛成纤维细胞的增殖活力、周期、凋亡以及DNMT1表达水平的影响。
　　设计三条不同的DNMT1特异性siRNA片段转染胎牛成纤维细胞。结果显示:DNMT1-siRNA3对DNMT1基因表达的抑制效果最好，在24h、48h、72h均与对照组有极显著差异(p＜0.01)，且在48h时，DNMT1-siRNA3对DNMT1表达的抑制水平达到了近80％;与对照组相比，DNMT1-siRNA3对胎牛成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)，且细胞活力显著下降(p＜0.05)。DNMT1-siRNA3与对照组相比可使细胞阻抑在G0/G1期(p＜0.05)。DNMT1-siRNA3可显著诱导细胞凋亡(p＜0.05)。因而，下调DNMT1可导致细胞增殖异常，活力下降，细胞凋亡增加，细胞周期阻滞。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 哺乳动物体细胞核移植表观遗传修饰研究进展

1．1 体细胞核移植技术与表观遗传修饰概述

1．2 胚胎早期发育重编程

1．3 基因组印记(Genomic imprinting)

1．4 X染色体失活(X Chromosome Inactivation，XCI)

1．5 染色质重塑(Chromatin remodeling)

1．6 组蛋白修饰(Histone modification)

1．7 DNA甲基化(DNA methylation)

2 影响体细胞核移植效率的因素

2．1 供体细胞的选择

2．2 受体细胞的选择

3 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’deoxycytidine，5-aza-CdR)

4 研究的目的与意义

第二章 5-氮-2’-脱氧胞苷对胎牛成纤维细胞的影响

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 主要分子生物学软件及数据库

2 胎牛成纤维细胞的准备和处理

2．1 胎牛成纤维细胞系的建立

2．2 细胞增殖-毒性检测

2．3 流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡

2．4 总RNA提取

2．5 总RNA质量、浓度和纯度检测

2．6 总RNA的反转录

2．7 引物的设计

2．8 PCR扩增

2．9 SYBR Green Real-time PCR

2．10 统计分析

3．实验结果

3．1 胎牛成纤维细胞系

3．1 5-aza-CdR对细胞增值-活力的影响

3．2 5-aza-CdR对细胞周期的影响

3．3 5-aza-CdR对细胞凋亡的影响

3．4 5-aza-CdR对DNMT1基因表达水平的影响

4．讨论

4．1 5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞增殖的影响

4．2 5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞周期的影响

4．3 5-aza-CdR对胎牛成纤维细胞凋亡的影响

4．2 5-aza-CdR对DNMT1基因表达的影响

5．小结

第三章 RNAi调DNMT1表达对胎牛成纤维细胞的影响

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 主要分子生物学软件及数据库

2 供体细胞的准备和处理

2．1 siRNA片段的设计与合成

2．2 siRNA干扰片段转染胎牛成纤维细胞

2．3 细胞增殖-毒性检测

2．4 流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡

2．5 总RNA提取、总RNA质量、浓度和纯度检测、总RNA的反转录、引物的设计、SYBR Green Real-time PCR

3．实验结果

3．1 RNAi下调DNMT1基因表达效果

3．2 RNAi调控DNMT1基因表达对胎牛成纤维细胞增值-活力影响

3．3 RNAi下调DNMT1基因表达对胎牛成纤维细胞周期影响

3．4 RNAi下调DNMT1基因表达对胎牛成纤维细胞凋亡影响

4．讨论

4．1 RNAi技术

4．2 RNAi下调DNMT1基因表达

4．3 RNAi调控DNMT1基因表达对胎牛成纤维细胞增值-活力、细胞周期、细胞凋亡的影响

5．小结

全文总结

1．总结

2 需要进一步研究的相关问题

参考文献

致谢