冬瓜、节瓜杂交种子纯度的SSR鉴定及其特征图谱的构建

摘要

冬瓜（Benincasa hispida（Thunb.）Cogn.）和节瓜（Benincasa hispida（Thunb.） Cogn. var. chieh-qua How）同属于葫芦科，皆为冬瓜属一年生攀援草本植物，后者为前者的变种，二者都是我国的特色蔬菜,并且是华南地区主要瓜类作物。本研究以广东省农业主导品种“铁柱168杂交冬瓜”和“夏冠一号节瓜”及其亲本为实验材料，运用SSR分子标记技术研究亲本与杂交种的特异性条带，找出共显性标记，旨在建立简便快捷的可用于两个杂交种纯度检测的技术体系，并利用筛选得到的核心引物构建冬瓜、节瓜主要品种的指纹图谱，用于DNA指纹分析，为构建更完善的冬瓜和节瓜指纹图库建立基础。主要研究结果如下：
　　1、对传统提取基因组DNA的CTAB法进行优化并尝试运用更为便捷的SDS法，本研究改良的CTAB法比原方法减少9个步骤，既省时又减少浪费，结果表明提取的DNA质量较好，而便捷的SDS法虽然提取的质量不如改良的CTAB法，但是经研究表明可以用于实验，并且更加简单易行。
　　2、本研究以杂交材料亲本DNA为模板经过重复实验从1100对SSR引物分别筛选出10对（铁柱168杂交冬瓜亲本）和14对（夏冠一号节瓜亲本）扩增条带清晰的特异性引物，通过进一步筛选得到2个（SSR101、SSR327）和1个（SSR81）共显性标记用于冬瓜和节瓜杂交种纯度鉴定，并通过TA克隆技术，测序得到这3个标记的特异性片段序列。
　　3、对用于种子纯度鉴定的特异性引物的PCR扩增程序进行简化，将原程序的5个阶段简化为3个阶段，用时约150 min调整为120 min。
　　4、通过人为掺杂试验表明，运用引物SSR81与SSR327能够准确检测出掺入的冬瓜、节瓜样本的假杂种。应用三个标记分别对不同生产批次的6个铁柱168冬瓜样品和3个夏冠一号节瓜样品进行室内纯度检测，并与田间形态鉴定结果进行对照表明，引物SSR101和SSR327、SSR81分别是这两个杂交品种较为理想的纯度检测标记，节瓜样品C27、C28、C29田间与室内检测结果的纯度差分别为5.000％、3.370%、0.9600%，而冬瓜样品情况比较复杂，由于母本与杂交种瓜形较为接近，鉴定存在一定偏差，需要进一步进行验证。
　　5、本研究通过对比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶和1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测后发现，后者更适合用于检测PCR扩增产物。
　　6、分别挑选5对和7对SSR引物用于构建冬瓜5个品种（系）和节瓜10个品种（系）的指纹图谱，并转化成数字指纹，结果表示，仅用引物SSR3（或SSR638）和引物SSR986可以分别将供试的冬瓜、节瓜品种（系）完全区分开。

目录

声明

缩略语表

引言

1 文献综述

1.1 杂交种纯度鉴定的主要方法类型

1.2 分子标记在葫芦科蔬菜中的研究进展

1.3 几种常用分子标记在种子纯度中的应用

1.4 本研究的目的及意义

1.5 技术路线

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 基因组DNA提取方法

2.3 模板样品浓度及质量检测

2.4 PCR扩增

2.5 电泳

2.6 数据处理

2.7 冬瓜、节瓜杂交种子纯度田间检测

2.8 特异条带回收测序

3 结果与分析

3.1 五种冬瓜、节瓜叶片基因组DNA的提取方法比较

3.2 PCR程序优化结果

3.3 琼脂糖凝胶电泳与8%PAGE检测PCR产物比较

3.4 SSR引物多态性筛选结果

3.5 实验室人为掺杂验证所筛引物的有效性

3.6 铁柱168杂交冬瓜纯度检测结果

3.7 夏冠一号节瓜纯度检测结果

3.8 冬瓜、节瓜主要杂交种DNA指纹图谱构建

4 讨论

4.1 SSR标记在冬瓜、节瓜杂交种纯度鉴定的可行性

4.2 SSR标记在冬瓜、节瓜杂交种纯度鉴定的可靠性

4.3 SSR引物通用性及PCR扩增的体系与程序的优化

4.4 基因组DNA提取方法

4.5 PCR产物检测方法

4.6 构建指纹图谱

4.7 展望

参考文献

附录

致谢