嗜热拟青霉β-木糖苷酶作为运载蛋白在大肠杆菌中的表达

摘要

大肠杆菌是目前广泛应用于重组蛋白生产的宿主菌之一，可提供快速且经济的方式，具有清晰的遗传背景，培养方式及操作简单，转化和转导的效率很高，繁殖快、成本低、密度高，大肠杆菌高效胞外分泌表达成为现在基因工程领域如重组蛋白包括药物和酶的生产、代谢工程等中颇为重要的研究方向之一。其中融合蛋白策略是现在利用工程菌表达分泌生产胞外重组蛋白的一个有用且普遍的方法。
　　大多数细菌来源的β-木糖苷酶主要存在于细胞中，而某些真菌可分泌β-木糖苷酶至胞外。大多数生物体分泌β-木糖苷酶都在较低的水平。来源于真菌嗜热拟青霉的GH43家族的β-木糖苷酶PtXyl43（简称X）近期被发现在大肠杆菌中有较高的分泌量。根据建模，X有一个包含5个刀状结构域的典型GH43家族β-木糖苷酶结构域。实验室前期研究中筛选得到两个可分泌的截短突变体。本研究在β-木糖苷酶X的C端和缺失结构域1或5突变体上融合了来源于枸橼酸杆菌属Citrobacter sp. P的几丁质酶Chitinase X（ChiX）、N-乙酰高丝氨酸内酯酶AIO6、绿色荧光蛋白Green Fluorescence Protein（GFP）、人源白细胞介素2（Human Interleukin-2）HIL-24种蛋白，以确定是否能够对于基因改造的蛋白发挥载体蛋白的作用。
　　研究结果显示β-木糖苷酶X在融合了ChiX、AIO6、GFP后可将其运输至胞外培养基中；β-木糖苷酶截短突变体X1234可运输ChiX和AIO6分泌至胞外，促进目的蛋白的分泌，同时可将GFP转运至周质中；β-木糖苷酶截短突变体X2345可引导几丁质酶ChiX、AIO6、GFP这3种目标蛋白的分泌。X将目标蛋白运输至胞外和周质的总量相比较于截短突变体增加，而截短突变体可能更趋向于将目的蛋白分泌至胞外。HIL2在融合了三个运载蛋白后反而丧失了分泌能力，但是在融合了木糖苷酶 X之后可溶的融合蛋白显著增加，表明木糖苷酶X的融合可增加蛋白的亲水性。与之相反，β-木糖苷酶截短突变体融合AIO6和GFP后不可溶融合蛋白增加，表明β-木糖苷酶截短突变体的融合增加了融合蛋白的疏水性。
　　β-木糖苷酶及其截短突变体在运载蛋白的能力上有差异，并对融合蛋白的亲水性及疏水性有一定影响，为以融合蛋白策略建立大肠杆菌高效分泌表达体系奠定理论和实验基础。

目录

声明

缩略语表 (Abbreviations)

1前言

1.1大肠杆菌表达系统概述

1.2β-木糖苷酶研究概述

1.3课题背景

1.4实验的目的和意义

2材料

2.1菌株与质粒

2.2工具酶与试剂盒

2.3主要实验仪器

2.4培养基及溶液

3方法

3.1β-木糖苷酶及其截短突变体作为运载蛋白载体的构建

3.2融合蛋白表达载体的构建

3.3融合蛋白诱导表达及亚细胞定位分析

3.4融合蛋白的胞外分泌量分析

4结果

4.1β-木糖苷酶及其截短突变体作为运载蛋白的载体的构建

4.2融合蛋白表达载体的构建

4.3融合蛋白表达初步分析

4.4融合蛋白表达亚细胞定位分析

4.5融合蛋白表达胞外分泌总蛋白含量分析

5讨论

参考文献

附录

致谢