芬氏纤维微菌去除黄曲霉毒素B1的可能机制及其对棉粕去毒效果的研究

摘要

黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性极强，在饲料和食品中普遍存在，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失，并严重威胁人类健康，因此有必要寻找一种有效去除AFB1的措施。微生物去毒法具有高效、无污染、处理条件温和、对产品品质破坏较小等优点，受到广泛关注。芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium funkei)是本实验室在环境中分离得到的一株细菌，对AFB1具有较好的去除效果，本试验在前期研究的基础上探讨了芬氏纤维微菌对AFB1的可能去除机制，优化了其去除棉粕中AFB1的固态发酵工艺条件，并通过肉鸭饲养试验对发酵棉粕脱毒效果进行了验证。具体研究内容及结果如下:
　　1、芬氏纤维微菌去除AFB1的可能机制
　　本试验将芬氏纤维微菌发酵后获得发酵液，去除其中菌体细胞获得胞外液，用70％硫酸铵沉淀胞外液得到蛋白粗提物和盐析上清液，分别用这四种组分处理AFB1。结果显示胞外液对AFB1的去除率为86.21％与发酵液无显著差异(P＞0.05)，胞外液中蛋白质粗提物对AFB1的去除效果最好，达81.17％。用蛋白酶K+0.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)处理、加热、调整pH和反复萃取等手段处理胞外液后，比较其对AFB1的吸附效果。结果显示胞外液经过蛋白酶K+0.5％SDS处理后对AFB1的去除率降至32.68％;胞外液浓度与AFB1去除率呈线性正相关;胞外液在强酸和强碱条件对AFB1去除率仍较高;100℃处理胞外液对AFB1的去除率升高7.42％;反复萃取与AFB1作用后的胞外液，AFB1的去除率下降6.63％。结果表明芬氏纤维微菌胞外液中的蛋白质和其他未知成分共同作用可能通过吸附等方式去除AFB1。
　　2、棉粕固态发酵工艺优化
　　通过用芬氏纤维微菌固态发酵AFB1污染棉粕，并优化其发酵条件，以获得较高的脱毒率。通过单因素试验，筛选出发酵温度、发酵时间、料水比和接菌量的最适范围分别为30℃、35℃、40℃，96h、120h、144h，1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7，5％、10％、15％;在单因素试验的基础上设计正交试验优化发酵条件，综合AFB1去除率、干物质损失率和发酵棉粕的感官指标三方面因素确定最优的棉粕固态发酵工艺为发酵温度35℃;料水比1∶0.5;接菌量15％;发酵时间144 h，在此条件下对棉粕进行发酵，AFB1去除率可达80％以上。
　　3、棉粕发酵脱毒的有效性验证
　　通过肉鸭饲养试验，进一步验证了芬氏纤维微菌的固态发酵脱毒效果。将140只5日龄樱桃谷肉鸭随机分为5个组，每组4个重复，每个重复7只雏鸭。试验组Ⅰ饲喂基础日粮;试验组Ⅱ日粮:10％ AFB1污染棉粕代替基础日粮中的豆粕;试验组Ⅲ日粮:2.5％发酵棉粕+7.5％ AFB1污染棉粕代替基础日粮中的豆粕;试验组Ⅳ日粮:5％发酵棉粕+5％ AFB1污染棉粕代替基础日粮中的豆粕;试验组Ⅴ日粮:10％发酵棉粕代替基础日粮中的豆粕。各组每天喂料2次，连续饲喂14 d，所有肉鸭自由采食和饮水。试验期间记录雏鸭采食量和日增重。于试验第7d和14 d，每个重复随机选取2只雏鸭，颈静脉放血致死。屠宰取样，测定脏器指数、血清生化指标、全血细胞计数(CBC)指标，并做肝脏病理学切片观察。
　　结果表明，AFB1污染棉粕组肉鸭与空白对照组相比，料重比(F/G)显著升高（P＜0.05）;肝脏、肾脏、脾脏指数显著上升（P＜0.05），法氏囊指数显著下降（P＜0.05）;血清AST、ALT、BUN、Cr显著升高（P＜0.05），血清TP和血清ALB显著降低（P＜0.05）;CBC指标WBC、LYM、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC均显著下降（P＜0.05），MCV、RDW显著上升（P＜0.05）;雏鸭有肝脏变性、坏死和出血、纤维化、结节状再生、胆管增生、空泡形成和脂肪浸润、肝细胞肿胀等病理学变化。与AFB1污染棉粕组肉鸭相比，随着发酵棉粕在日粮中添加比重增加，F/G逐渐下降并达到空白对照组水平;肝脏、肾脏、脾脏指数下降，法氏囊指数上升并达到空白对照组水平;血清AST、ALT、BUN、Cr降低，血清TP和血清ALB升高，接近或达到空白对照组水平;CBC指标WBC、LYM、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC逐渐升高，MCV、RDW逐渐下降接近并达到空白对照组水平。结果表明棉粕发酵后AFB1含量大大降低，对AFB1造成的肉鸭生长性能下降、免疫抑制、肝脏和肾脏损伤、贫血等危害有明显的缓解作用。
　　综上所述，可得出以下结论:芬氏纤维微菌能够高效去除AFB1，发挥去除作用的主要成分是其胞外代谢产物中的蛋白质及其它成分，去除方式可能是吸附作用。棉粕固态发酵的最适条件为发酵温度35℃;料水比1∶0.5;接菌量15％，发酵时间144 h，在此条件下棉粕中AFB1去除率可达80％以上。采用最适发酵条件对AFB1污染棉粕进行固态发酵后饲喂肉鸭能够在一定程度上缓解AFB1造成的雏鸭生长性能下降、肝脏和肾脏的损伤、免疫抑制和贫血等负面影响。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一部分 文献综述

1 前言

2 黄曲霉毒素的结构和理化性质

3 黄曲霉毒素的代谢途径

4 黄曲霉毒素的毒性作用

4．1 黄曲霉毒素的致癌、致畸、致突变作用

4．2 黄曲霉毒素对免疫系统的抑制作用

4．3 黄曲霉毒素对胃肠道的影响

4．4 其他毒性作用

4．5 黄曲霉毒素的残留

5 黄曲霉毒素的脱毒方法

5．1 物理脱毒方法

5．2 化学法

5．3 生物学方法

6 棉粕中AFB1污染状况

7 选题依据与研究内容

7．1 选题依据

7．2 研究内容

第二部分 材料与方法

1 试验材料

1．1 主要仪器及设备

1．2 主要试剂

1．3 原料

1．4 试验菌种

1．5 试验用培养基

2 试验方法

2．1 AFB1的检测方法

2．2 芬氏纤维微菌发酵液对AFB1去除效果研究

2．3 棉粕固态发酵脱毒工艺优化

2．4 动物饲养试验

2．5 数据处理

第三部分 结果与分析

1 芬氏纤维微菌去除AFB1的机制研究结果

1．1 确定芬氏纤维微菌发酵液去除AFB1组分结果

1．2 不同处理对胞外液去除AFB1效果的影响

2 棉粕固态发酵工艺研究结果

2．1 供氧与否对发酵效果的影响

2．2 接菌量对发酵效果的影响

2．3 发酵时间对发酵效果的影响

2．4 发酵温度对发酵效果的影响

2．5 料水比对发酵效果的影响

2．6 棉粕固态发酵条件优化结果

3 动物试验结果

3．1 肉鸭生长性能

3．2 对肉鸭脏器指数的影响

3．3 对肉鸭血清指标的影响

3．4 对肉鸭CBC的影响

3．5 肉鸭肝脏组织结构变化情况

第四部分 讨论

1 芬氏纤维微菌去除AFB1的可能机制

2 棉粕固态发酵脱毒工艺

3 固态发酵棉粕对雏鸭生长性能的改善效果

4 固态发酵棉粕对雏鸭健康状况的改善效果

4．1 发酵棉粕对AFB1造成的肝脏损伤的缓解

4．2 发酵棉粕对AFB1造成的肾脏损伤的缓解

4．3 发酵棉粕对AFB1造成的雏鸭免疫抑制的缓解

4．4 发酵棉粕对AFB1造成的雏鸭贫血的缓解

第五部分 小结

1 结论

2 问题与创新

参考文献

致谢